简化复杂荧光多孔板分析

用SiR Actin、TMRE、CellEvent™和DAPI标记的U2OS细胞;13小时延时成像;凋亡诱导剂staurosporine U2OS_cells_with_apoptosis_inducer_added.jpg

细胞凋亡,或程序性细胞死亡,发生在有机体胚胎发育期间,以消除不需要的细胞,以及在成人愈合期间,以清除体内受损的细胞,帮助预防癌症。多孔板Caspase实验允许研究人员研究细胞凋亡的早期阶段。在这篇文章中,我们展示了云母如何在荧光多孔板分析的关键应用中使用,以提供100%的时空数据相关性并最大限度地减少串扰。

在引入凋亡诱导剂staurosporine后,用SiR Actin、TMRE、CellEvent™和DAPI标记的U2OS细胞的图像,在13小时的延时成像中拍摄。

荧光分析基础知识

多孔板是非常有用的实验,要求较高的产量。它们使用户能够为并行执行的384、96或24个不同的实验(样本)收集数据[1].现代检测试剂盒通常基于荧光探针或染料标记感兴趣的蛋白质。然后用荧光显微镜分析每个孔板中荧光标记的样品(2、3).荧光多孔板分析用于神经科学、癌症研究和发育生物学等领域的各种应用,其中高通量使其更实际地进行大量分析。幸运的是,许多这些荧光分析试剂盒都可以在市面上买到,这有助于极大地简化样品制备,为用户节省了大量的时间和精力。

凋亡和Caspase蛋白

细胞凋亡,即程序性细胞死亡,发生在有机体胚胎发育过程中以消除不需要的细胞,以及在成人愈合过程中以清除体内受损细胞并帮助预防癌症(4 - 6).半胱氨酸蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶的一个大家族,在细胞凋亡的启动和执行中起着至关重要的作用(5、6).启动子caspases帮助启动细胞凋亡,而执行子caspases进行大量的蛋白质水解。Caspase-3和caspase-7都是刽子手caspase(5、6、7).在凋亡过程中,caspase-3在细胞结构破坏中起协调作用,caspase-7在细胞脱离中起协调作用[7]

半胱天冬酶化验

Caspase分析可以研究细胞凋亡的早期阶段。在这里,研究了细胞毒性药物,如staurosporine,对caspase-3和capase-7的剂量依赖性激活。为了消除随机效应,在相同条件下,即使用不同浓度的一种药物或多种药物的组合,检查多个测定样品。统计学意义上显著的结果通常需要实验重复几次。

caspase检测的挑战

caspase分析的典型读数是caspase激活级联何时开始的信息。然而,关于单细胞的其他形态学或激活反应的问题仍然没有答案。在这种方法中加入更多的荧光染色剂可以获得更多的信息,例如,细胞凋亡期间的细胞骨架行为或细胞色素c介导的凋亡小体组装导致caspase-3-和caspase-7裂解途径的激活[8].很难足够快地收集检测中所有荧光标记的信号,从而达到在整个样品载体上获得数据的分配时间间隔。其次,以快速可靠的方式从多达四个荧光标签中分离信号可能具有挑战性。最后,当数据与caspase活性没有同时获得时,它们之间的相关性并不直接。

由于这些挑战,在进行caspase分析实验时,特别是在结合额外的标记以获得更多的信息时,通常会存在一些问题。上下文和形态数据可能会丢失或不具有时空相关性,即与位置和时间相关。此外,荧光标签之间的串扰可能导致对结果的误解。

目前,相当数量的研究实验室可能无法随时获得涉及这些分析的工作所需的所有仪器和显微镜。这个问题通常通过访问多个研究小组和用户使用的共享设施来解决,但这可能意味着需要很长时间才能获得所需的仪器。

这些挑战可能会导致延迟获得重要的、可量化的结果,从而导致根本性突破和获得新的见解。

介绍云母

Mica是世界上第一个成像Microhub,它将研究人员所需的一切统一在一个完全受控的、高度灵活的环境中,加速显微镜工作流程,以更快地获得有意义的科学结果。通过使用这个Microhub,您可以从以下方面受益:

  • 所有人访问:Mica允许设置复杂的分析读数,即使是没有经验的用户
  • 无约束:Mica允许用户同时成像4个标签,具有100%的时空相关性
  • 从根本上简化工作流程:Mica结合了4个标记的收集和人工智能驱动的数据分析,所有这些都显著减少了工作流程步骤

方法

云母用于这一关键应用,与荧光多孔板分析有关caspase-3和caspase-7在细胞凋亡激活中的作用(图1).从U2OS细胞系制备样品,最后用staurosporine诱导细胞凋亡。该实验结合了多个与细胞凋亡早期阶段相关的读数。

结果

结果显示在图1显示staurosporine诱导的caspase-3和caspase-7的激活,在此之前是应力纤维的形成和线粒体膜电位的耗尽。

利用云母(Mica)实现了4种能够监测早期凋亡诱导的荧光标记的绝对时空相关性(参见视频1和图2).观察到应力纤维的形成与caspase-3开始时线粒体膜电位的丧失和caspase-7激活相一致。caspase激活后直接发生DNA缩合。

视频1:U2OS细胞在宽视场模式下63倍放大的延时视频,并进行13小时延时采集:a)细胞被标记为SiR-Actin, TMRE(63倍放大,线粒体活性),CellEvent™(caspase活性)和DAPI(细胞核)。在时间点0时加入凋亡诱导剂staurosporine。

在传统的宽视场显微镜和云母之间的时空多色采集的比较显示在图3.在研究线粒体动力学时,同步荧光标记检测在可视化线粒体结构和膜电位时消除了时空伪影。当使用传统的宽视场成像时,时序采集产生的时空伪影会使测量结果失真,并阻碍结构和功能的相关性。Mica提供flusync,可同时获取并确保时空相关性。没有伪影,膜电位与线粒体结构正确相关。

同时4标签成像,广谱检测和混合分解[9]都可以通过云母荧光同步实现[10]与传统的宽视场显微镜不同(参考图4).

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