荧光作为显微镜中的工具
荧光在显微镜中广泛应用，是观察特定分子分布的重要工具。细胞中的大多数分子不发荧光。因此，它们必须用一种叫做荧光色素的荧光分子进行标记。感兴趣的分子可以直接标记(例如带有DAPI的DNA)，也可以用与特定抗体偶联的荧光染料对其进行免疫染色。免疫染色通常需要固定细胞。
荧光显微镜还可以对活细胞或组织进行延时成像。为此，我们可以用基因编码的荧光分子来标记感兴趣的蛋白质绿色荧光蛋白(绿色荧光蛋白)。感兴趣的分子(如Ca2 +)也可以用可逆结合的合成染料(如呋喃-2)或转基因的天然蛋白质(如呋喃-2)进行标记。绿色荧光蛋白衍生物)。
电子能态的变化导致发光
发光描述了发光效应的发生，这种发光效应是由电子从激发态到低能量态的变化引起的。电子可以以不同的能态存在。基态对电子来说是一种非常稳定的状态，具有最低的能级。如果电子吸收能量，它们可以被提升到更高的能级，即激发态。由于激发态的能量高于基态，当电子回到基态时，能量必须被释放出来。这种能量可以以发射光子的形式释放出来。
发光有几种不同的形式，系统的激发方式不同，例如，在电致发光中，系统是通过电流激发的，化学发光是由化学反应产生的，光致发光是由光子激发产生的。
光致发光可进一步分为两个亚组，荧光和磷光。荧光和磷光的主要区别在于它们发光的持续时间。当照明停止时，荧光立即结束。相比之下，磷光可以在激发结束后持续数小时。
荧光的机理
荧光剂只有在相应波长的光照射下才会发出荧光。波长取决于荧光团的吸收光谱，必须确保传递适当数量的能量将电子提升到激发态。电子被激发后，它们只能在这种高能态中停留很短的时间。当电子放松到基态或另一种能级较低的态时，能量以光子的形式释放出来。由于在这一过程中损失了一些能量，与吸收的光相比，荧光色素发射出波长增加而能量较低的光。
磷光的机理
由于磷化分子的发光时间比荧光染料长得多，因此它们储存激发能的方式必然有所不同。这种差异的基础在于两种形式的激发能级，单线态激发态和三重态激发态，它们基于不同的自旋对准。
自旋是电子的一种属性。简而言之，自旋描述的是电子旋转引起的角动量。电子自旋的方向可以是正的(+1/2)或负的(-1/2)。高能级的自旋对彼此的方向可以是平行的，也可以是反平行的。在反平行自旋对中，各个角动量相互补偿，总自旋值为零。这种自旋对齐称为单线态。两个平行自旋不补偿，得到一个不等于零的值。在这种情况下，自旋被称为处于三重态。
当电子从单线态激发态回到基态时，就会发生荧光。但在某些分子中，受激电子的自旋可以转换为三元态，这一过程被称为系统间交叉。这些电子失去能量，直到它们处于三元基态。这种状态的能量比基态高，但也比单线态激发态低。因此，电子不能切换回单线态，也不容易回到基态，因为根据量子力学，只有值为零的总自旋才被允许。分子因此被困在它们的能量状态中。
但是从三元基态到基态的一些变化是可能的。这些变化引起光子的发射和磷光。由于一次只能发生少数几个事件，三重基态形成了一种能量蓄水池，使磷光可能在更长时间内发生。
显微术中的发光
对显微镜来说，荧光是最有用的一种发光。荧光染料很容易通过特定光源(如灯具和滤光系统或激光器)以特定波长激发，发射的光可以通过波长(斯托克斯位移)与激发光区分开来。
利用荧光成像，实验者可以描述细胞内分子的数量和定位。荧光显微镜的另一个优点是可以同时使用几种荧光色素。荧光素只需要在激发波长和发射波长上有所变化。因此，不同的目标分子可以同时观察，允许进行各种各样的实验，如共定位研究。
