斯托克斯转移
荧光的一个重要特征是Stokes位移。它描述了激发光子和发射光子在能级上的差异。荧光色素发出的光子的波长比激发光子的波长大。这是由于在荧光色素被激发后,但在它释放光子之前,向周围释放能量。由此产生的波长偏移使得区分激发光和发射光成为可能。能量的吸收和发射可以看作是一个分子物种的特定特征。
荧光显微镜
近年来,led(发光二极管)也被用作荧光显微镜的光源。发光二极管发出的光的波长取决于用于生产的材料。然而,在大多数情况下,需要一个激励滤波器,因为led经常发出一个相当宽的波长范围的光。
大多数荧光显微镜是外部荧光显微镜。照明器和物镜位于样品的同一侧,光不会通过样品。除了激励和发光滤波器之外,这种荧光显微镜需要二向色镜。二向色镜允许一定波长的光线通过,而其他波长的光被反射。过滤器和二向色镜通常在过滤器立方体中插入。

所述激发光通过所述激发滤光片并指向所述二向色镜。这将光线通过物镜反射到标本上。标本中的荧光色素被激发并发出光子。这种发射光通过物镜返回到二色镜。发出的光具有适当的波长并能够通过。被试样反射的激发光不能通过二色镜而被阻挡。如果激发光能够通过二色镜,那么当它到达发射滤光片时就会被阻挡。通过发射滤光片的光可以用探测器测量。
不同类型的过滤器用于荧光显微镜。频带通行证,可以区分长通和短通滤波器。带通滤波器发射波长带,而具有更大或更小的波长的光将被阻挡。长通和短通滤波器是边缘过滤器。长通滤波器传输长波长的光。具有高于某个截止值的波长的光不能通过。相反,短通滤波器传输短波长并块长。
荧光显微镜的不同技术
荧光显微镜应用广泛,特异性强。各种技术使解决不同的问题成为可能,甚至可以绕过恩斯特阿贝所描述的衍射极限。
一个分子物种的定位可以通过细胞器的共同染色来确定,例如细胞骨架或细胞膜。共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)可以观察样品的区域没有信号从焦平面外部,并允许光学切片。整体内反射(TIRF[)显微镜是一种允许观察靠近细胞表面的薄区域的技术。蒸发田激发该区域的荧光料。
用于观察分子物种的动态的技术是光漂白后的荧光恢复(Frap.).在限定区域内的荧光染料被光漂白,并且未漂白分子进入该区域的扩散可以被测量。相互作用研究可以通过荧光能量转移(烦恼)显微镜。兴奋的供体色团可以将能量转移到受体荧光色谱并激发它。只有在两者都非常紧密地聚集,这才是可能的。如果这些染料偶联到不同的蛋白质,如果蛋白质相互作用,它们只能能够转移能量和荧光。
允许亚分辨率图像的技术是受激发射耗竭(st)显微镜、基态耗尽(GSD)显微镜、单分子和基态耗尽显微镜,然后单个分子返回(GSDIM)和光活化的定位显微镜(棕榈)随机光学重建显微镜(风暴).用于这些技术的亚分辨率显微镜也被称为纳米显微镜,因为它们能在纳米尺度上分辨图像。