控制TIRF渗透深度是可再现结果的强制性

确定渐逝场的渗透深度的另一个因素是激发所需的激光的波长。这可能成为一个问题Tirf.使用多种荧光团的实验。在不同激光线之间切换的这样的实验中，将导致渐逝波的不同穿透深度。必须非常小心地对这些实验的结果进行解释，因为由渐逝波穿透的样本的体积，因此激发的荧光团的数量随着激发波长而变化。为了获得可靠和可量化的结果，必须以恒定值保持渐逝波的穿透深度。只有通过通过相应地改变所选择的激光线的入射角来补偿由激光线产生的渐逝波的不同穿透深度，才能实现这一点。

这使得这使得Tirf.传感器是系统的特殊部分，因为它允许检测到总内部反射的发生。因此，实验者可以100％确定获得的图像是真实的Tirf.图片。在全自动对齐过程中，Tirf.扫描仪通过目标的反芯平面移动激光束Tirf.传感器检测到全内反射发生的一系列扫描仪位置。利用这些信息，系统然后计算 - 考虑激光束的波长 - 用于所有可能的扫描仪位置的所得渐逝波的穿透深度。

在对准之后，可以在保持渐变波的恒定穿透深度的同时在激光线之间切换，因为扫描仪将自动将激光束的位置改变在物镜的反码平面中。这确保激光始终具有所需的入射角，以产生相对于激光波长的渐逝场的所需穿透深度。结果是可自由的可定定的，但对于所有可用波长的渐逝波的稳定性和完全可再现的渗透深度。

图3：Tirf.MDCK细胞外壳膜囊泡中的荧光标记的RAB11（绿色）和GAL3（红色）蛋白的图像。使用不同的穿透深度设置获取图像。左上角：90 nm，右上角：110 nm，左侧：150 nm，右侧：200 nm，左下角：250 nm，右下方：epi模式。注意越来越多的可见囊泡并减少信噪比。用徕卡am获得的图像Tirf.MC系统。由德国Philipps大学Marburg博士学位，细胞生物学研究所和缩细胞学博士博士礼貌。

采用高度灵活的Tirf.扫描仪具有额外的优点。如上所述，系统精确地识别出激光位置（或扫描仪位置）的全内反射，反之亦然，在那里不是这种情况。完全了解全内反射的究竟在哪里，并且不可用于在特殊所谓的HILO模式下照亮样品。如果激光以低于全内反射所需的临界角度的角度遇到玻璃/水界面，则激光束将倾斜地通过样品。因此，激光束仅遇到样本的部分，并且仅激发该体积中的荧光团。与传统的渗流图像相比，这导致具有低背景的图像和非常良好的信噪比。该方法的额外益处是大大降低了漂白和光毒性，延长了细胞活力，特别是在长期实验中。HILO模式特别适用于动态运动的定量研究，分子的分布和相互作用和单分子跟踪。标准应用是囊泡跟踪。

一个的另一个优点Tirf.可自由定义耦合位置的扫描器可以选择激光遇到玻璃/水界面的方向(所谓的方位角)。这意味着消失波的波前方向是可以选择的。这反过来又影响了倏逝波的传播方向(相对于玻璃/水界面的水平或垂直)。而传播方向又会影响荧光团激发效率，因为它们通常是具有一定取向的偶极子。在徕卡Tirf.系统可以在四个方位位置之间进行选择，以确保荧光团的最佳激发。