偏振上皮细胞顶膜的TIRF显微镜观察

偏振上皮细胞的血浆膜分为两个明显的分开部分;与器官腔或细胞培养，培养基和基石结构域面临的顶端膜结构域，其与相邻的细胞或细胞外基质连接。两个膜结构域通过紧密的连接分离，并具有它们自己的特定蛋白质和脂质含量。用于将这些组分的细胞内运输到其特定靶膜中的经典模型系统由MDCK细胞（Madin-Darby-Canine - 肾，其中用于本文中使用）提供。对细胞内分选方法的研究对于了解细胞的蛋白质和脂质贩运系统具有根本的重要性。这些组分的错误靶向可导致器官缺陷，例如在肺部的各种疾病中发现的器官缺陷，肠道和肾脏。突出的例子是囊性纤维化或先天性蔗糖酶 - 异氨基酰氨酸酶缺乏症。

我们团队在菲利普大学马尔堡细胞生物学与细胞病理学研究所的研究课题是阐明MDCK细胞顶端细胞质膜的蛋白质分选。的应用Tirf.显微镜(简言之:TIRFM)被证明对这项工作非常有用。TIRFM利用全反射的物理现象来产生所谓的倏逝场。这一领域仅延伸到几百纳米的穿透深度，并在其范围内激发靠近覆盖玻璃的荧光团(图1)。

用的是徕卡AMTirf.本文提到的MC，基于徕卡dmi6000b荧光显微镜，激发光进入细胞的穿透深度可以从70 ~ 300 nm连续调节。在实际应用中，这可以用来激发细胞质膜附近的荧光标记蛋白，在我们的极化上皮细胞中。

图1：用于顶端TiRFM的实验装置：在多孔膜（PET过滤器）上播种MDCK细胞并孵育几天。为了观察细胞的顶端部分，PET过滤器从其塑料支架上移开，并倒置放置在一个Bachofer腔体中，与安装在那里的盖玻璃紧密接触。188金宝搏的网址为了确保电池紧贴盖玻片，在PET过滤器的顶部放上4克的重量。由于这种排列方式，排列有微绒毛的MDCK细胞的顶端位于被激光全反射的覆盖玻璃表面产生的倏逝场内。仅激发该字段内的荧光颗粒，因此可见。

MDCK细胞被播种在多孔膜(PET过滤器)上并孵育几天。为了观察细胞的顶端部分，PET过滤器从其塑料支架上移开，并倒置放置在一个Bachofer腔体中，与安装在那里的盖玻璃紧密接触。188金宝搏的网址为了确保电池紧贴盖玻片，在PET过滤器的顶部放上4克的重量。由于这种排列方式，排列有微绒毛的MDCK细胞的顶端位于被激光全反射的覆盖玻璃表面产生的倏逝场内。仅激发该字段内的荧光颗粒，因此可见。

观察MDCK细胞的顶膜区域是一个特殊的技术挑战，因为，不像Tirf.在基石膜结构域中的荧光团的激发，可以将细胞直接培养在覆盖物中，用于检查顶端侧的细胞首先在培养皿中形成偏振上皮。这是通过在多孔宠物过滤器上生长它们以获得上皮单层来完成的。然后将具有偏振电池层的过滤器从它们的安装件中切断并倒置到覆盖物的覆盖物的覆盖物。通过将额外的重量放在滤光器上来实现细胞的顶端膜和覆盖物处的渐逝场之间的物理接近。

图2A显示了通过TiRFM制备的MDCK细胞的顶端膜结构域的常规绝荧光图像和各种荧光团的图像的比较。这里，与其顶端分选受体，Galectin-3相比，研究了一种主要的顶端膜蛋白，即神经营养蛋白受体（P75）。两种蛋白质用荧光蛋白质，P75标记，具有EGFP（P75-GFP.)和galectin-3与DsRed (Gal3-DsRed)在荧光显微镜下成像。而传统的荧光图像往往产生漫射光在整个细胞体在两个通道，而Tirf.图像显示出极其清晰和结构清晰的物体。大多数是指状的根尖膜突起，即所谓的微绒毛，被p75修饰，或在某些情况下被半乳糖凝集素-3修饰。

观察细胞的基底外侧(图2b)Tirf.尽管该膜结构域中的蛋白质较少，图像再次显示更清晰的结构。与离荧光图像相比，细胞边框更清楚地划明并具有更无形的线。该图像还显示了细胞质膜周围的窄场中TiRFM的有限激发范围。这由细胞内GAL3-DSRED阳性对象显示，该阳性物体出现在渗流模式中，但是未被TIRFM的渐逝场检测到。

图2a-b: epifluorescence microscopy和TIRFM的比较
答：对于顶端Tirfm，mdckp75-GFP./Gal3-DsRed细胞在PET滤镜上培养，并用徕卡AM观察Tirf.MC基于徕卡DMI6000 B荧光显微镜。而epifluorescence图像(左图)只显示了漫射光Tirf.相同细胞的图像(右)能够分辨出微小的结构(箭头)。它们通常是管状的，表现出两种标记物的荧光。
b:对于基底外侧TIRFM，相同的细胞系直接培养在Bachofer室的盖玻片上，也观察Tirf.显微镜。再一次,Tirf.图像的分辨率更高。此外，远低于细胞表面的红色信号在TIRFM(箭头所指)中没有被激发。比例条:10µm

要了解图2A中所示的细胞的高压结构是否是微流程或细胞内结构，MDCK_{我- - - - - -GFP.}或mdck._Gal3-DsRed细胞系先进行免疫荧光染色，但不使细胞通透。因此，抗体不能进入细胞内部，而只能染色细胞表面的结构。可见，一些物体位于细胞内，可能是位于MDCK细胞顶膜下方的内体隔间。这些物体只能用荧光融合蛋白可见，而不能用免疫荧光。作为对照，在抗体处理前，细胞被洗涤剂皂苷渗透。在这种情况下，免疫荧光图像与那些GFP.或DsRed信号(图3c)。

图。图3A-C：TiRFM图像显示在细胞质膜上和恰好下方的结构。
答:MDCKp75 -GFP.将细胞培养在PET过滤器上，并在没有先前的透明化的情况下进行免疫荧光，使用抗P75抗体染色。因此，仅染色细胞表面上的P75结构，而不是细胞内（左）。并行看看p75-GFP.信号表明，TIRFM接收细胞质膜上和内部的结构，以及在它下面的一个小区域。图示管状元素(箭头)，与表面抗体信号不同。
b: MDCKGal3-DsRed细胞也获得了类似的图像。在这里，细胞内Gal3-DsRed信号也没有被表面的抗体所接收(箭头所指)。
c:在控制，MDCKp75-GFP.免疫荧光染色前先用洗涤剂使细胞通透。在这里，两个信号是相同的。比例条:10µm

TIRFM是观察质膜或其直接环境中的细胞过程的有用工具。它既可用于观察固定组织，也可用于观察活体组织，必要时可用于观察多个荧光通道。这些先决条件使我们有理由希望，使用TIRFM技术无法清晰检测到的根尖膜近端突起或结构将很快被可视化。