TIRF显微镜
它允许靠近玻璃/水(或玻璃/标本)界面的荧光分子成像。这是通过使用一种倏逝波来激发荧光团，而不是通过弧光灯、led或激光器发出的光直接照明来实现的。当入射光在两种不同折射率的透明介质的界面上完全反射时，会产生倏逝场。在生物应用中，入射光通常是激光和覆盖层的玻璃界面以及覆盖层与贴壁细胞之间的水溶液膜。
当消失场的能量随距离界面的距离呈指数衰减时，只有靠近盖层一定距离的荧光团被激发。这使得图像的信噪比非常高，因为细胞其余部分的荧光团很难被激发。此外,TIRF显微技术提供的图像具有卓越的高轴向分辨率低于100纳米。这允许观察膜相关的过程，如细胞粘附，激素结合，分子运输和胞外和胞内过程(如神经递质释放和摄取)。
全内反射和消失场
当光遇到两种不同折射率的透明介质的界面时，会发生部分衍射和部分反射。在一定的入射角，也就是所谓的临界角，光线会被完全反射，这时就会出现一种叫做全内反射的现象。只有当光从折射率较高(n)的介质(例如玻璃盘，n = 1.52)传播到折射率较低的介质(例如水介质，n = 1.33)时，才能观察到全内反射。临界角度(ΘC)，它可以由斯涅尔定律决定:
n1和n2分别为样品的折射率和覆盖层的折射率。
当发生全内反射时，入射光的一部分能量将转化为电磁场并通过界面，形成源自界面的倏逝波。出现的倏逝波与入射光的频率相同，其振幅随穿透深度呈指数衰减。因此，倏逝波中的荧光团不是由与光子的相互作用激发的，而是由与电磁场的相互作用激发的。该领域的穿透深度通常在60到100 nm之间，但也可以达到200 nm。它取决于光线的入射角、波长和两种介质的折射率(例如盖玻片和样品)。增加光的入射角会导致穿透深度减少，而较高的入射光波长会导致穿透深度增加。界面后介质(如试样)的折射率对穿透深度也有影响，较高的折射率增加了倏逝波的穿透深度。还应该说明TIRF显微术是利用比一般共焦系统中使用的激光更强的高功率激光，形成具有足够能量的倏逝波。
TIRF显微镜的目的
在光学中实现全内反射有两种方法:一种是基于棱镜的方法，另一种是基于物镜的方法。在prism-basedTIRF显微术，一个棱镜附着在盖片表面，将聚焦光束或激光导向盖片/介质界面。在棱镜的帮助下，穿透光的角度被调整到临界角。
现代TIRF显微镜系统通常是基于客观的。光线，通常是激光，通过物镜直接照射到样品，物镜也收集发出的荧光。这是强制性的目标TIRF显微技术具有极高的数值孔径(NA) (> 1.45 NA)，允许入射角大于临界角。物镜的NA越高，消失场的可能穿透深度就越低，因为光线的入射角会更平坦。物镜法与棱镜法相比，物镜法使用起来更方便，因为物镜法可以很好地获取样品，而且可以很容易地改变激光的入射角。通过将激光光斑放置在物镜后焦平面的不同区域，用户可以选择激光的入射角，从而改变消逝波的穿透深度。在prism-basedTIRF显微镜系统的棱镜强烈限制了对标本的访问，使其难以改变介质，添加药物或进行生理测量。
此外，在基于棱镜的系统中，激光的对准和使用不同的入射角要复杂得多。此外，基于棱镜的激光安全问题也出现了TIRF系统被基于目标的系统所克服。虽然在棱镜系统中的激光或多或少是被公开引导进入棱镜，在物镜系统中的激光直接耦合到显微镜本身，并以非常明确的方式退出物镜。
在生物装置中完全的内部反射
如上所述,TIRF显微镜物镜具有高数值孔径(> 1.45 NA)，这只能通过浸泡油或其他专门的液体浸泡介质来实现。在典型的生物装置中，用于产生消逝波的激光必须通过物镜、浸没介质和覆盖层，然后在覆盖层/水(例如水溶液林格液、PBS或其他成像缓冲液)界面上反射。为了避免反射和偏转效应，浸没介质的折射率必须尽可能接近覆盖层的折射率(通常n = 1.52)。对于标准浸渍油，在20°C时，折射率n= 1.515 - 1.518。当然，浸没介质的折射率与温度有关。由于许多实验，特别是活细胞成像，都是在37℃下进行的，因此温度会引起浸没介质的折射率变化。为了纠正这些变化，许多TIRF显微镜物镜配有矫正项圈。
在生物装置中，全反射发生的界面通常是n = 1.52的玻璃盖层和盖层与细胞(n = 1.33)之间的水介质小膜之间的界面。然后消逝场通过这个水膜，直径约为7.5 nm的质膜，并进入细胞的胞质，在一定的穿透深度下它下降到零，穿透深度取决于激光的入射角。在一些地方，细胞直接粘附在盖玻片上，盖玻片和细胞之间没有水溶液(例如在细胞的局部粘附处)。在这种情况下，覆盖层和单元之间的界面就是全部内部反射的地方。由于电池的折射率(大约n = 1.38)不同于水溶液，当系统设置在盖层/水溶液界面时，这些斑点可能不可见。根据斯涅尔定律，全反射发生的临界角取决于介质的折射率，因此覆盖层/水溶液界面和覆盖层/电池界面的临界角是不一样的。这个问题可以通过改变激光的入射角来解决。
由于衰减场的性质是指数衰减，只有在覆盖层/水溶液界面(或电池本身)大约60-100 nm范围内的荧光团(取决于设置)被激发。这提供了通常为60-100纳米的轴向分辨率(z平面)，使我们能够观察位于质膜或靠近质膜的荧光团，而不会被位于细胞其余部分的荧光团的荧光淹没。事实上，只有细胞“切片”中的荧光团被消光场激发，这导致图像具有非常好的信噪比，几乎没有来自失焦平面的背景荧光。
