TIRF显微镜的技术优势
最大的优势TIRF显微术是其出色的信噪比。由于倏逝场的穿透深度较低，失焦荧光最小化，因此几乎不会出现任何背景荧光。由于只有一部分细胞暴露在电磁倏逝波的能量下，因此有害氧的产生以及细胞的光毒性应力也大大降低。这显著提高了细胞活力，并允许更长的实验持续时间。此外，低水平的光漂白只发生在细胞的一小部分区域。由于有稳定的新荧光团从细胞质进入该区域，信噪比在很长一段时间内保持不变。此外，荧光团的适用范围TIRF显微镜(如EGFP, Fluo-4等)是宽的，并且只受到可用激光线的限制，所以活细胞成像技术像烦恼，弗拉普，钙成像等都很容易进行。连接光敏摄像头可实现高速图像采集，以观察快速事件。另外,，TIRF显微镜可以与其他显微技术相结合，如外荧光显微镜和亮场对比方法。的一个缺点TIRF显微镜的优点是，到目前为止，只有贴壁培养的细胞可以用于实验，例如切片，通常不够接近覆盖/介质界面，使倏逝波穿透标本。
TIRF显微镜在生命科学研究中的应用
通过使用空间受限的倏逝场来激发荧光团，TIRF显微镜可以在靠近质膜的光学部分（通常在100纳米左右）观察分子和过程的定位和动力学。这对于处理质膜内或接近质膜的过程的许多应用是有利的。
TIRF显微镜是一种极好的结合技术空间信息动力学研究在活样本中，甚至在体外。它通常用于研究分子运输，如发生在细胞骨架组装。图像采集速度快，背景消除效果好TIRF显微镜为观察动态事件提供了极好的条件，如蛋白质向质膜募集。例如，可以研究动力蛋白/动力蛋白介导的转运动力学。它也可以跟踪整个细胞器，如线粒体使用TIRF显微镜。在细胞间相互作用的研究中，可以很容易地看到细胞的局灶性黏附等特殊结构TIRF用显微镜观察细胞骨架部分向灶性粘连的募集。
通过将数学模型(如质心跟踪方法)与无与伦比的信噪比和z分辨率相结合TIRF显微镜,单分子的亚扩散有限局部化可实现1纳米的精度。这是可能的，因为由倏逝波激发的荧光团从离焦荧光团产生低背景荧光，从而在规定体积的样品中产生低信噪比（例如，倏逝波穿透深度乘以视野面积）。在传统的基于灯的荧光系统中，光束路径中的所有荧光团同时被激发和检测，而不需要任何关于其z位置的信息。
换句话说:在获得的图像中，由于细胞的不同z平面显示为一个平面，荧光团的三维分布仅在二维中显示。这导致图像中荧光团的叠加，这往往使单个荧光点的识别不可能。在TIRF然而，在显微镜下，在大约100 nm的深倏变波中只有相当少的荧光团被激发，从而提供了样品的光学z截面。
中荧光点之间的空间邻近性TIRFx和y方向的图像相对较低，因为其他z平面的荧光团发出的光没有覆盖检测到的信号。如果应用数学模型(例如质心跟踪方法)来计算检测到的荧光分子的质心，则单个分子的亚衍射有限定位是可能的，精度为1纳米。
另一个大的应用领域TIRF显微镜是对物体的检查膜融合过程如泡贩卖. 由于倏逝波仅激发靠近质膜的荧光团，因此可以监测内吞小泡的形成以及分泌小泡与质膜的融合。为此，囊泡可以通过标记胞吐货物蛋白和荧光蛋白来标记，如绿色荧光蛋白．
由于光学切片，可以将荧光强度的变化解释为荧光标记小泡进入或离开消失场的运动，或货物的释放或摄取。一个相当缓慢的强度增加意味着一个运动进入消失场，因此一个运动朝向质膜。当分泌囊泡与质膜融合时，随着货物被释放到细胞外空间，荧光信号迅速减少。反之亦然，通过使用荧光底物（如标记的葡聚糖）可以观察到内吞作用，细胞在内吞过程中吸收葡聚糖。
另一个发生在质膜上的重要过程是细胞信号（例如g蛋白偶联受体的信号）。例如，这里可以观察到信号级联中单个分子（例如g蛋白）的招募或移动。
所有图片:由德国马尔堡大学临床细胞生物学和细胞病理学教授R. Jacob提供
