FCS -方法论
FCS是一种光谱方法。在这种情况下，“试管”是衍射受限的光斑(图1)。因此，人们使用显微镜的原因是有一个高数值孔径透镜，它将光束聚焦成飞升大小的光斑。使用显微镜的一个可喜的副作用是，可以为测量点(ROI)的参考和定位样品拍摄图像。在FCS主要读出的是随时间变化的荧光强度(荧光迹或强度迹)。荧光涨落隐式地编码粒子数(即涨落幅度)和粒子停留时间(即涨落频率)，见图2。我们进行了自相关分析(“自相似性测试”)和曲线拟合，以定量地获得这些参数(图3和图4)。激发光和探测光在共聚焦光点中的几何形状大致遵循三维正态分布。通过用高斯函数逼近它，可以找到一个解析模型FCS自相关函数。其参数及其物理意义如表1所示。
图1(左):观测体积及重要参数。扩散时间τD表示分子在观测体积内所花费的时间，即分子侧向扩散所需要的时间。右侧给出观测体积的横向延伸(束腰)w0，轴向延伸z0。它们的比值z< >0/w< >0是结构参数，κ。
图2(右):荧光强度图。分子进出观察体积(上一行)的运动导致荧光强度的随机波动。
图3(左):自相关原理。荧光的痕迹被复制，相乘，然后总结结果。这样做了多次，每次移动第二个数据集的增量τi(滞后时间)。在小的滞后时间之后，数据仍然是自相似的，导致一个更大的总和(红色)。更长的班次意味着更小的数字(绿色和蓝色)。这种技术分析分子在观察体中扩散频率的潜在信息。
图4(右):自相关函数G(τ)在滞后时间t上绘制。G(τi)代表不同的滞后时间，从图3(红、绿、蓝点)定性绘制。在G(0)处的振幅编码粒子数n的倒数。在半最大振幅(拐点)处的时间产生扩散时间τD，也称为相关时间。通过适当的校准，可以从这些数字中得到浓度c和扩散系数D。
有关“解剖”的细节FCS曲线，即哪些过程在什么时间域被观察到，以及关于这个主题的一般介绍，请参阅Petra Schwille和Elke Haustein的一篇在线文章［3］．
三维高斯三重态模型
| 参数 | 的名字 | 意义 |
| ρ | 电流幅值 | 由分子种类贡献的G(0)振幅 |
| τD | 扩散时间 | 分子在V内的时间eff |
| τT | 三个一组的时间 | 分子处于黑暗状态的时间 |
| T | 三个一组分数 | 处于黑暗状态的分子的一部分 |
| κ | 结构参数 | V的偏心距eff， k = z0/ w0 |
表1:单分子种数据拟合三维高斯三重态模型参数及三维正态扩散。
校正-从相对数字到绝对数字
这两个主要参数FCS测量值是扩散系数τD，分子数n。它们分别与扩散系数D和浓度c直接相关。然而,τD和N是受单个仪器和几个实验参数影响的相对数字。获得绝对数字D和c是仪器校准的目的。
的有效体积
扩散时间和分子数量这两个参数都取决于观测体积的大小。这里将其称为有效体积Veff．校准是关于确定V的大小eff．
校准的策略
确定V的三种方法eff在文献中描述:
- 三维荧光珠共焦体积测量及三维高斯函数拟合。
- 准备浓度序列，把N作为c的函数画出来，斜率得到Veff．
- 用已知d测量已知染料。曲线拟合得到τD和V的keff可以计算。
每种方法都有其缺点和优点。例如1。给出了对共焦体积的精确描述，并提供了关于3D高斯近似如何保持的细节。它不像实际测量那样在水溶液中测量。第二种方法是无模型的，对V的几何形状没有任何假设eff或者说扩散模型。因此，它不包含关于其形状的信息，如果不使用曲线拟合来估计N，它是费力的，可能会受到暗态的影响，但它适用于大范围的浓度。最后一种方法在非常接近实际的条件下工作FCS测量，包含一些关于V的几何信息eff并且易于实现。下面我们将逐步地研究这一战略。有关这三种方法的详细比较，请参阅［1］．
通过曲线拟合得到有效容积
由于这种方法是基于曲线拟合的，所以结果的质量很大程度上取决于模型对现实的描述。最有力的假设是一个三维高斯几何Veff，通常是这样做的FCS分析。因此，系统的失调将导致这一假设被违背。此外，自相关的良好信噪比是必需的，因为τDk是通过拟合相同的数据集确定的。在0.1 nM到10 nM的浓度范围内，明亮的光稳定性染料能最好地实现这一点［1］．有效体积如式1所示。
公式1:有效体积。与观测量有关的大小FCS测量w0为横向，z0为轴向。这两个参数依赖于τD和通过校准测量的曲线拟合得到的κ。请注意，Veff比文献中通常提到的共焦体积大2^(3/2)~ 2.8。
参考文献
- 王志强，王志强，王志强:基于荧光相关光谱的反应系统热力学波动。理论物理。莱特修订版29 (1972)705-708
- 基于荧光相关光谱的单分子超灵敏检测。生物科学3 (1990)180-183
- http://www.biophysics.org/Portals/1/PDFs/Education/schwille.pdf