斑马鱼脑-全器官高分辨率成像

用徕卡SP8光谱共聚焦激光扫描显微镜对斑马鱼全脑成像

当人们试图理解复杂的生物系统时,结构信息是关键,而最复杂的生物结构之一是脊椎动物的中枢神经系统。要从发育中的斑马鱼身上解剖出一个完整的大脑,需要覆盖大约10平方毫米的区域,深度在毫米范围内。通常,低倍率镜头不能提供足够的分辨率来揭示神经组织中复杂的结构相互作用。此外,由于散射过程,使用共聚焦显微镜在致密生物组织中成像的深度通常被限制在约10微米。

解决方案

威斯康辛医学院的林克实验室研究眼部发育和188bet怎么注册疾病,专注于斑马鱼视网膜神经发生的模型。埃里克·克拉克(Eric Clark)是林克实验室的博士候选人,他试图创建斑马鱼整个大脑的全体积3D图像,其深度约为750微米,覆盖面积约为直径3毫米。为了对神经系统成像,动物首先在泛神经元启动子后面转染表达eGFP的结构,从而在中枢神经系统的神经元中产生无处不在的绿色荧光。

样品清理和物镜

为了减少由折射率(RI)变化引起的散射,采用被动清透法对分离的CNS样品进行清透。基于Histodenz的自定义折射率匹配方案被用来保持整个光路的RI一致。用徕卡HC flutar L 25x/1.00 IMM物镜对制备的器官进行成像[1],提供250纳米的光学分辨率,在约1mm x 1mm的领域,高达6毫米的自由工作距离。该物镜配有机动校正(motorcorr)项圈,可以对其进行调整,以补偿在深度的RI方差的影响。

动画:eGFP染色斑马鱼(泛神经元启动子)的3D渲染视频动画。总尺寸0.75 x 2.5 x 3毫米。5675 x 7836 x 286像素过夜记录。激发波长为488 nm。排放499 - 569海里。详情见正文。

采集高分辨率大场

为了从整个大脑中收集数据,Eric使用了磁片扫描功能拉斯维加斯X NAVIGATOR采集软件。Navigator允许用户简单地将光学图像堆栈记录在大量拼接的微观场中,并将它们融合到单个3D数据集,自动平衡拼接和采集过程中的强度变化。可以渲染生成的数据通过3D可视化软件包括3D查看器在内拉斯维加斯X(见电影图01)。

最终数据由286个图像平面组成,每个图像平面为5675 x 7836像素。总共12.7千兆体素。

光子效率和样品保护

从荧光样品中收集如此庞大的数据集的先决条件是一个非常灵敏的检测系统,必须在相对较短的时间框架内以最小的光漂白达到高信噪比。为了完成这一任务,使用配备了徕卡几乎无噪声混合探测器的共聚焦显微镜进行成像[1](HyD),一种声光分束器[2]国内企业)和基于棱镜的光谱探测器[3]SP-detector)用于无滤波器的光谱分离和自由可调的带宽规格。

用户的声音

“带电机的徕卡清晰物镜提供了匹配样品清除/安装介质的折射率的能力,并提供了扩展的工作距离和光收集能力,以成像这种敏感的样品在深度。”

埃里克·克拉克,威斯康星医学院博士候选人。188bet怎么注册威斯康星州密尔沃基(美国)

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