类型的传感器
真正的共聚焦扫描显微镜将照明的光聚焦成单个点。为了生成一个二维图像，这个点必须在样本的x和y方向上进行扫描。虽然扫描设备在设计和制造上需要付出一些努力，但与宽视场相机芯片相比，传感器可以是一个单一的设备，它必须提供尽可能多的传感器元件，并同时提供所要求的图像元件(像素)。由于不需要xy读出电子元件，单点传感器与阵列探测器相比具有更好的信噪比。
光电倍增管(PMT)
到目前为止，最有名的共焦成像传感器可能是经典的PMT(图01)，它在80多年前的20世纪30年代早期就开始了它的职业生涯[1]．它是基于最先由H.赫兹描述的光电效应[2并由A.爱因斯坦解释[3.]．一个光电阴极，通常是一层碱原子，可以轻易释放电子吸收光子，暴露在辐射源(这里，光集中在光电阴极)。在可见光范围内，砷化镓磷化阴极(GaAsP）.电压使光电子加速到第一个dynode，在那里次级电子被释放。由于dynode材料的特性，dynode处的增益通常被限制在5倍以下。一个dynode产生的电脉冲不能与电噪声区分开来。为了获得足够的增益，次级电子被加速到下一个dynode，以此类推[4].此程序允许增益高达10左右8甚至更多，这足以采集到可测量的电流。
光电倍增管具有非常宽的动态范围，即它们可以用于非常低的光子密度和相当高的强度。
雪崩二极管(adp)
一种与真空PMT相对应的半导体随着一种美国，是PIN二极管的衍生物。PIN二极管的特点是在p型和n型层之间有一个额外的稀疏掺杂层。的美国是一种改进的PIN二极管，由倍增层补充(图02)。如果一个光子被本征层吸收，它将产生电荷对(内光电效应)，然后电荷被施加的电压加速。在倍增区(图02中的p-n)的强电场通过释放许多(高达约1000)附加电荷引起放大。输出信号与吸收的光子数成正比，因此，该设备可以作为一定强度范围内的光传感器。在较高的电压下，光子的吸收导致击穿，伴随着非常高的增益(高达108“盖革模式”），该模式通常用于单光子检测。由于连续击穿会破坏设备，因此该模式仅适用于足够低的光强度。
apd已经成功地应用于单光子测量，特别是在这部电影(荧光寿命成像)和FCS（荧光相关光谱学）实验。然而，它们很少用于共焦图像记录。
混合探测器（液压、HPD）
PMT的主要限制是每个乘法步骤的低增益美国它的主要限制是它的操作范围:只有非常低的强度(在盖革模式下)。这两种技术的混合组合提供了一种解决方案，幸运的是，它显示了这两种技术的优点。这种真空和半导体技术的结合最初是为粒子物理实验而开发的[5]．
混合探测器使用光电阴极，比如PMTGaAsP最佳的性能。光电子由大约8000伏特的高电压一步加速。高能光电子击中半导体目标，在那里动能被耗散，并转换成分离的电荷(电子-空穴对)。这一步的增益已经是1500左右了。下面的倍增层(见雪崩二极管)将信号再次放大约100倍。现在只要在阳极上接收到可测量的信号就足够了。信号是一系列电脉冲，每个脉冲与到达阴极的一个光子相关。
参数
尽管这三类传感器都能将光子转换成电信号，但它们的工作原理却大不相同。为了找出哪种传感器最适合共焦成像，我们将简要地看一下三个重要参数:
- 噪音,
- 脉冲均匀性，以及
- 脉宽。
如果我们想使用光子计数而不是模拟集成，后两个是非常重要的[6]光子计数更精确，并给出像素信息与样本亮度的正比。
噪音
在各种噪声源中，暗噪声严重影响低强度图像的质量。在我们的上下文中，暗噪声表示阳极上的信号（电脉冲）没有光子被阴极吸收。它基本上由敏感元件的温度及其大小决定。例如，如果温度高到足以导致偶尔从阴极材料释放电子，光电阴极本身将在绝对黑暗中发射电子。该电子被加速由施加的电压产生d，并在阳极处产生一个看起来像光子脉冲的脉冲。此外，双节点可能会发射热电子，其中第一个双节点产生的脉冲高于靠近阳极的双节点。由此，我们可以得出结论，来自双节点的热电子是一个仅与PMT相关的问题：HYD和美国没有双节点。光电阴极和双节点的热电子出现对应于半导体材料的热电荷分离。整体暗噪声由来自所有可能贡献者的电子组成。如果需要非常低的暗噪声，传感器将受益于冷却：温度降低约5 K时，暗噪声减半（取决于材料）。对于极低强度的应用，甚至使用液氮冷却，从根本上消除暗噪声。
阴极尺寸约为50毫米的经典pmt2，加上额外的倍增区，具有相当高的暗噪波（见表01）这阻止了它们在光子密度非常低的应用中的使用。对于活体样品实验，目标是使用尽可能暗的照明灯，以避免光毒性反应破坏样品。不幸的是，这一要求将使噪声问题成倍增加。APD和HYD没有动态节点。对于这些设备，暗噪声主要由传感器的活动区域控制美国通常约为0.05毫米2，即非常小，需要额外的方法和努力将光稳定地聚焦到目标上。请记住：共焦显微镜使用的不是固定光束，而是扫描光束。再加上光学部件的多种选择，对精确对准的需求甚至会增加。液压系统的有效面积约为7 mm2，小到足以抑制暗噪声[7］并且足够大，即使在紧张的条件下，也能确保完全拾取光信号。
脉冲高度分布
理想情况下，从阴极释放出的任何光电子的输出脉冲看起来都是一样的。尽管，从实际情况来看，这一假设远非真实，特别是对于pts，我们将在下面看到。不仅脉冲宽度和光子吸收与输出脉冲峰值之间的时间(称为“渡越时间”)在变化，而且脉冲的高度也在变化。脉冲高度的变化直接引起信号的变化(噪声)，这些信号是通过积分阳极电流记录下来的。在光子计数的情况下,脉冲高度的变化可能导致计数损失如果无法区别电子脉冲噪声的放大电路(见标签1和图4,事件# 2在PMT的情况下相当于事件# 3和# 4在海德拉巴的情况下)。
输出脉冲的高度基本上由第一放大阶跃的增益决定[8]．对于PMT，这是第一个dynode处的增益。如上所述，增益受到dynode材料的限制，在2到8的范围内。变化是由泊松统计控制的，例如，如果我们假设平均增益为4，变化是+/- 2，这意味着在下一次事件中有一个很好的机会从2到6个电子。然后，脉冲高度大约以3倍的倍数变化。后来的dynode的增益具有相同的统计行为，但随着电子数量从dynode增长到dynode，这些变化被平均，对噪声的贡献较小。
在HyD中情况完全不同，第一步的增益是1500。增益的变化与它的平方根(泊松统计)成正比，因此，峰值变化的变化小于3%，这是PMT情况的100倍。特别是，由于脉冲高度一致，用HyD进行光子计数要精确得多。如前所述，光子计数是强度测量的黄金标准。
脉冲宽度
光子计数是通过计数传感器输出的脉冲来完成的。强度越高，脉冲频率越高。当强度超过一定水平时，脉冲开始一起“熔化”，单个事件无法分离(见图04和表01)。这种光强度水平显然与电脉冲的宽度密切相关:脉冲越细，用于成像的光强度就越高。通常用于共聚焦成像的pmt会产生相当长的脉冲，大约在20纳秒的范围内。光强度是在给定的图象元素中每单位时间检测到的光子数量。在光子计数模式下，强度被描述为“每秒计数”。如果光子以同样的20纳秒的时间到达，一秒钟就可以保存5000万个计数(每秒50兆个账户，即50 Mcps)。但是光子是以随机的方式从样品中发射出来的，因此最大允许的脉冲只有大约15 Mcps。一个标准的荧光样品在共聚焦体积下可以传输大约100 Mcps，所以它的信号在光子计数模式下无法用PMT测量。 APDs are limited in dynamic range due to the long dead time the sensor needs for regeneration after each pulse. Photons that arrive during the pulse duration and dead time are lost. Only very low intensities can be quantified accurately with APDs.
HyD显示约1纳秒的脉冲。带有HyDs的SP8平台可以以高达300 Mcps的速度工作，因此，适用于标准荧光共聚焦成像。它的动态范围涵盖非常低的光强度和用于共聚焦成像的标准荧光染色样品。
总结
与光电倍增管(PMTs)相比，混合探测器(HyDs)的噪声非常低，如表01的第一行所示。暗噪声水平可与雪崩光电二极管(美国)此外，脉冲非常均匀，这使它们成为光子计数的理想设备-类似于APD，如表01第二行所示。PMT和APD之间的区别在于没有延迟时间的极短脉冲宽度（表01中的第三行）。这种差异允许HYD用于检测荧光样品的典型强度，而美国在低强度情况下（如高速实时成像）和标准荧光样本下，HyD都会生成清晰的荧光图像，背景为真正的黑色。
hyd配备了砷化镓磷化物(GaAsP)阴极。HyD的量子效率为GaAsPpmt。然而，由于光电子的轨迹短而直，HyD的光子探测效率甚至比pmt更好。
顺便说一下，hyd也是特殊应用的理想传感器，如荧光寿命成像(这部电影)荧光相关光谱法(FCS)，因为它们显示非常窄的凌日时间变化，本质上，脉冲后没有变化(详情参见参考7)。这使得HyD成为任何基于光束扫描的显微镜传感器的冠军。
参考文献
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- 爱因斯坦A:《物理学年鉴》322,Nr. 6, 1905, S. 132-148。ISSN 00033804。doi: 10.1002 / andp.19053220607
- Rajchman J & Pike EW:“二次发射倍增器中的静电聚焦”RCA技术报告TR-362, 1937年9月9日
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- Borlinghaus RT，Birk H和Schreiber F.“灵敏检测检测器：HyD”当前显微镜对科学和技术进步的贡献；编辑：Méndez Vilas（2012）
- Pawley J:“点、像素和灰度:图像数据数字化”;生物共聚焦显微镜手册。爱德华:J.帕利，第三版。我们施普林格(2006)
