为什么我们需要分束器?
一种可能的分割显微技术是指方向，光被应用到微观主体(图1)．如果样品位于光源和观察者之间，即样品被“照射”，那么我们使用术语“透射光学显微镜”。另一种方法是在观察样品的同一侧进行照明，称为“入射光显微镜”。事实上，我们日常生活中的观察主要与入射光有关:我们周围的世界是由阳光或人造光源照亮的。我们随后识别出被物体反射或散射的光，例如树木、汽车、危险的动物或人类。透射光可能在特殊情况下发生，例如，如果你检查窗户上的一只死苍蝇。
当你直视光源时，比如蜡烛、夜空中的星星、萤火虫或电视屏幕(避开太阳)，那么在这种情况下，我们就有了第三种观察:感知“自发光物体”。这些物体不需要照明，因此，术语“入射光”和“透射光”不适用。
入射光显微镜已经成为生物医学研究中最重要的技术，在其他领域也是如此;188bet怎么注册尤其是荧光显微技术。光被吸收，从而激发荧光分子——通常用人工方法将荧光分子纳入标本中。经过一段时间的延迟后，能量从分子中释放出来，但波长(斯托克斯位移)比入射光长。
如果我们用我们也检测到发射信号的同一侧的所需颜色照亮样品，我们必须以某种方式将激发光和发射光分开。为了完成这项任务，需要一个分束器。
经典的方法:二色镜
入射照明(也称为:外延照明)可以通过将光以与显微镜光轴有关的角度照射在样品上进行。罗伯特·胡克在1665年已经描述了这种照明模式。这种方法在入射照明和透射照明之间的边界上的一个极端变化是光照指向垂直于光轴的轻片显微镜(超微显微镜)。与光轴同轴照明具有同一高性能物镜既可用于照明又可用于检测的优点。在这种情况下，我们必须在物镜后面的某个点分离照明和探测。要做到这一点，最简单的方法是在光束路径中插入一个半透明的镜子(图2“镜像”)．
对于反射光，灰色的镜子将是最好的解决方案。灰色镜子反射和透射的所有颜色都是等量的，因此它也被称为50/50分束器。在荧光中，这样的设计会有一半的宝贵的荧光发射丢失的缺点。一个解决方法是使用不对称的灰色分割器，例如80/20或甚至95/5分割器。在这里，大部分的发射被挽救，但更大一部分的激发光被浪费了。二色分色器解决了这个难题。根据设计的不同，它们显示出高反射率和高透明度的交替光谱带。
二向色镜是在玻璃表面沉积许多薄层介电材料制成的。设计和制造都很复杂。然而，有大量不同的分束器可用。这些分裂镜可用于单一类型的荧光或用于多种激发和发射(图3)．在所有情况下，反射镜必须反射特定波长波段内的激发光，并以互补波段传输发射光。发射效率由发射带的整体透明度和激励带的窄度来定义。在多波段分配器的情况下，当激发波段与荧光信号的发射波段重叠时，效率降低。
当前二向色分束器在发射光谱区域的传输效率通常在90%到98%之间-足够接近最大传输。然而，反射带的宽度范围通常是25纳米(或更小)。对于单一用途的分路器，如果激励线靠近传输开始的边缘，这样的带宽可以忽略不计。然而，在大多数情况下，需要多个激发波段，因此25 nm带宽会导致发射信号损失(取决于荧光团发射)。
二向色分光镜最重要的参数是滤光玻璃的光谱参数是不可修改的。如果需要改变激发和发射特性，则必须在光束路径中插入不同的分裂镜。通常，一个滑块或一个轮子配备了许多不同的分离器，但很少超过5个。这种方法有两个结果。首先，激发波长的可能组合是有限的。即使我们假设一个系统配备了8条激光线，那么255种不同的组合也是可能的。为了获得最佳性能，需要一个配备了255个不同分离器的过滤轮或滑块——这并不是一个切实可行的解决方案。因此，在许多情况下，必须使用多波段分光器与一系列不同的荧光染料组合，发射信号可能丢失在光谱的红色部分(见蓝色曲线图3)．第二个障碍是这些过滤器的交换速度。对于照明状态的快速变化，例如，需要连续记录两组激发或激发比染料的情况下，滤波器组交换率是至关重要的。标准设备的切换时间大约为1秒。特殊设计可以达到0,1秒或稍好一点。
声光晶体的可调谐光束劈裂
在入射光系统中，有一种完全不同的分离激发和发射信号的方法，利用声光活化晶体的特性(图2国内企业”)．这种装置的工作原理是基于这样一个事实，即声波应用于适当的晶体会导致选择的颜色以不同的角度离开晶体，与剩余光谱相比。哪些颜色会偏转，偏转到什么程度可以由所施加声波的频率和振幅来控制。此外，还可以施加一系列声波，从而使一组几乎可以自由选择的颜色偏转。这种晶体在共聚焦显微镜中的首次应用导致了激发路径中选择滤波器的大阵列的替代。
第二个实现是替换主分束镜的存储库。这里，声光晶体以反向模式使用。声光器件强烈依赖于偏振，这对激光激发没有问题，因为激光无论如何都是偏振的。要解决发射信号的极化分裂问题，必须采取相应的措施。下面我们将简要介绍这种设备的设计。
激光被耦合到第一个晶体中，并沿显微镜的光轴从该晶体中射出，以激发样品(图4)：
光通过一个小镜子沿显微镜的光轴耦合。由于激光是偏振的，元素以这样的方式排列，使得偏振方向可以激发样品。任何其他偏振方向都会以不同的角度离开晶体。然而，激光只包含一个偏振方向。线路可以在几微秒内通过重新编程来切换。由于编程频率是自由可调的，所以激励颜色也是自由可调的。如果需要多个激发颜色，则所有激光线以相同的方式同时同轴馈送到光束路径中(不需要多路复用)。同样，激发机制可以在微秒内切换。
荧光发射通常不极化。两个方向在第一个晶体中分裂，需要合并(图5)．
两个偏振方向在第二个晶体中结合，并沿显微镜的光轴退出这个晶体。然后，光在空间上被针孔过滤，针孔产生光学切片，就像在任何其他真正的共聚焦显微镜中一样。最后，光被分离成光谱通道，检测，并记录图像。
的国内企业使用发射光必须通过的两个声光晶体。然而，平均传播率为95%，如图所示图3(红色曲线)。测量结果显示在图3完美地揭示了国内企业约95%的传输在外可调激励带，即在传输带。
事实上，不同的颜色不会在同一位置从第二个晶体中退出。这些射线是平行的，但不是同轴的。这个结果会影响光学切片吗?因为光线是平行的，所以它们被聚焦在中间图像中针孔所在的同一点上。光学切片性能国内企业系统与采用不同方式分离激发光和发射光的系统相同。另一个问题是:色散是否影响光谱性能?是的，的确，但我们可以利用它:光谱分离在SP徕卡微系统公司的探测器是通过188金宝搏的网址棱镜来实现色散的。光谱“预分散”光束被优雅地处理SP检测器，只获得进一步有益的性质。
为什么AOBS优于二色镜
声光分束器提供了一系列有益的特性:
- 由于它是一个单一的机械固定装置，所以从不存在各种元素调整不当的问题。
- 产生的波的电子控制导致在10µs内快速切换线路。
- 由于晶体具有高性能的抗反射涂层，该装置的总体透射率平均为>95%。
- 一种设备适用于任何激光线，因为带的颜色可以调整到任何可见波长。
- 由于可自由调节的弹带颜色国内企业是唯一的装置，使耦合白光激光光源共聚焦显微镜实际。
- 这是可能的程序的整个系列的小带，允许国内企业作为一个多波段分配器，目前最多可同时使用8种颜色。当与白源结合时，可能的激发组合的数量达到“亿万”。
- 用户只需选择所需的激励颜色，共焦系统将安排适当的滤波和分割。控件不需要单独的控件国内企业(主光束分裂)和声光可调滤波器(AOTF;选线)，因为两者由相同的设备操作。
