共聚焦成像是生命科学中荧光成像的现行标准。功能性成像超出了传统的分子物种的位置和浓度的记录，并且能够进一步研究分子功能：它们与其他生物分子的相互作用以及它们的活性，构象，分子环境和翻译后修饰。理想情况下，这必须以高时的分辨率完成。荧光寿命被精致地提出报告生物分子功能状态，因为分子保持在激发态的时间高度依赖于其环境和与其他附近物种的相互作用[1,2]。随着寿命信息与荧光团浓度无关，它是功能性成像的选择方法[3]。但是，有几个因素限制了广泛的应用fl。对于一种，传统的时间相关的单光子计数（TCSPC）解决方案本质上慢且难以实现，特别是对于复杂的成像工作流程。所以，fl迄今为止，成像只限于专门的实验室，即使有专家知识，传统的TCSPC也无法提供在几十秒以下时间尺度发生的生物过程的速度。
为了克服速度和实验复杂性的这种限制，我们开发了一种用于测量寿命的创新概念（图1A）。这flSP8 Falcon上的方法基于共聚焦扫描头，具有现场可编程门阵列（FPGA）电子设备，脉冲激光激发和快速，光谱单光子计数检测器。来自每个检测器的激光脉冲和光子到达脉冲的信号以非常高的速度数字化，时间分辨率为97 ps。数据流作为通过FPGA控制的模式识别识别算法分析的比特流。该步骤从检测脉冲和激光脉冲到达时间之间的差异确定光子到达时间。通过测量与探测器脉冲的激光脉冲的时间差来避免抖动伪影。这些步骤直接在系统电子器件上执行，确保最大速度和保持信号质量。然后将数据传送到计算机以产生图像，从总光子到达时间构建衰减曲线并计算荧光寿命。这些直接测量来自检测和激发脉冲之间的到达时间的差异是直接在线呈现为“快速”fl' 图片。
传统TCSPC的速度限制来自长电子和/或检测器死亡时间，使系统无法跟上典型的现代共焦制度的光子通量。为了避免由于所谓的堆积效果而低估了寿命[4,5]，传统的TCSPC系统在每次激光脉冲0.01和0.1光子之间的光子通量下操作[5,6]，测量误差约为2.5％[7]。先前已经描述了纠正堆积效果的努力[4,8-12]。
SP8 FALCON采用了两种互补的方法，能够在高光子通量下终生捕获。第一种方法包括将多个探测器组合为一个探测器(图1b)。这多亏了SP8平台和SP8猎鹰电子的全光谱灵活性。光谱的灵活性使探测器的范围可以自由调整，以覆盖单一发射光谱，电子处理来自多个探测器的信息，就像它来自一个单一的。探测器的加入增加了光子通量，这可以在采集前或在分析步骤中设置。事实上，SP8 FALCON保存了单个检测器比特流的信息，因此它们可以在任何时候一起或单独进行分析。这种多探测器的方法，加上整个系统在1.5 ns以下的死区时间，使精确fl每个脉冲的1光子速率的测量值（图2E，有关详细信息，请参见下文;当与80 MHz脉冲激光器一起使用时，每个检测器可以达到高达80个MCP。第二种方法是实现高速fl光子过滤器以避免堆积效果。该过滤器确保了高光子通量在高光子通量下整体寿命衰减的忠实表示。
除了高速fl过滤器，我们实现了两种额外的模式来评估数据的质量（图2）：'第一光子'滤波器和“所有光子”模式。“第一光子”滤波器（图2A）专门从每个脉冲后检测到的第一光子内构建荧光衰减。该过滤器模仿传统的TCSPC及其固有的堆积效果（图2B），结果低估了寿命值。在较高的计数速率下，测量的寿命人为地减少[2]（图2E）。“所有光子”模式（图2A）与检测到的所有光子构成荧光衰减。虽然该选项具有显着增加光子统计的优点，但它也引入了一些偏差，如果未校正，则可能导致错误的寿命（图2E）。然而，“所有光子”方法产生的寿命比传统TCSPC更小。
使用高速fl滤波器（图2A），我们实现了高光子统计和准确的寿命值，同时误差（图2E）。通过这种过滤器，我们确保只使用脉冲之间的单光子事件用于构建和拟合整体衰减。然后，SP8 Falcon Electronics和新颖的架构允许我们直接从Patting等人使用这个整体模型和方程（正式1）。[12]对于像素逐个像素fl形象健康。这将导致:
其中荧光衰减f(t)用模型函数进行修正;具有IRF、仪表响应功能;Ai，寿命分量的振幅;B,背景;P:激光脉冲数;τ,一生;而td，是死的时光。
从高速获得精确的整体衰减曲线后fl过滤器，我们可以为逐像素计算应用适当的数学模型。在每个像素处，我们使用未过滤的数据来构建衰减和整体数学模型的拟合。
通过这种双方法，我们确保使用最佳的拟合模型，以及适当的光子统计（图2C）。这对于展示具有非常不同的光子制度的子区域的样品特别有用。为了说明这一点，我们将Hela细胞与EPAC阵营的非常可变的表达式成像flSensor13（图2D）。所有细胞都具有相等的CAMP水平，对应于测量的寿命为〜3.5ns（图2D中的黄色像素）。“第一光子”和“所有光子”过滤器在高噬孔通量的明显寿命中显示出严重的错误。高速fl滤波器捕获所有光子通量的准确寿命值，每脉冲高达2.5光子。
为了量化每个滤波器的效果，我们在增加激光功率的情况下使用罗丹明B溶液进行寿命测量，每次衰减的计数至少为100万次(图2e)。我们最初用0.01光子每脉冲进行测量，并将其设置为参考寿命值。这些测量使我们可以直接看到计数率的增加对寿命测定的准确性的影响。我们注意到，使用“第一个光子”滤波器，在20-40 Mcps时，堆积效应已经成为一个重要问题。当使用“全光子”方法时，测量的寿命更接近参考值，但仍然产生较低的值。标准的高速fl在SP8 FALCON上的滤波器(图2e中的红色正方形)允许在高达225 Mcps的光子状态下确定一致的罗丹明B寿命，误差在0.2%和1.6%之间。数据显示，SP8 FALCON显著增加
光子通量区域可用于可靠的寿命测量。
高速flSP8猎鹰的记录是要求苛刻的生物实验的关键资产。例如，它可以对活患者来源的结直肠癌类器官中ERK的活性进行时间延迟记录14(图3)。ERK信号是结直肠癌和其他几种癌症类型中恶性细胞生长的重要驱动因素，我们使用改良版EKAREV生物传感器15记录了ERK信号。
总之，这种EW发现的速度性能在共聚焦和多光子功能成像中，以及终身成像的无缝集成到所有强度的基于共聚焦成像和加工工具中，使得能够在以前无法达到的时间尺度进行研究生物过程。
视频1：Live 3Dfl在一个病人来源的器官上。用ERK监测活类器官中癌症引起的信号转导活性的增加烦恼-fl生物传感器。显示功能信息烦恼ERK生物传感器的效率。更高烦恼效率表示更高的ERK活动。
视频2:Fast Calcium振荡with SP8 FALCON在组胺刺激和装载Oregon Green 488 Bapta-1 AM的HeLa细胞中观察到快速钙振荡。视频:由Kees Jalink, Bram van den Broek，荷兰癌症研究所提供。
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