Förster共振能量转移(FRET)

荧光描述光子从分子或原子自发发射后，激发电子系统吸收光。与激发光子相比，发射光子通常具有更少的能量，因此具有更长的波长(斯托克斯位移)。例如，蓝色激发可能导致绿色发射。如果第二个荧光分子可以吸收绿色光子，该分子的发射再次发生斯托克斯位移，例如变成红色。这种重吸收在一定程度上造成了在比较密集的样品中测量荧光的误差(部分是“内滤”效应)。在低浓度的样品中，重吸收是一个非常罕见的事件。

如果两个分子在空间上非常接近(几纳米)，能量可以直接从“供体”“跳跃”到“受体”而不发生光。这种直接的能量交换被称为“Förster共振能量转移”，烦恼．“共振”表明这两个分子必须共享能量窗口。窗口是施主的发射光谱和受体的吸收光谱。尽管光子既不会被发射也不会被重新吸收，但能量方面的考虑仍然成立。的概率烦恼随着两个光谱的重叠面积上升，如果窗口更适合，更多的能量通过。此外，分子的取向对转移效率也有影响。

对于上面的例子，如果样品被蓝光照射，收集到的发射通常是绿色的。如果烦恼发生时，红光子也会被发射出来，相应地绿色光子也会减少。最极端的情况是完全转移所有的能源，完全没有绿色排放。的烦恼效率的定义是吸收的蓝色光子的数量除以发射的红色光子的数量，因此可以假设值从0到1。对于一个给定的烦恼对,烦恼效率表示两个荧光物种之间的空间距离-这是目标烦恼测量(2］．

作为烦恼荧光试剂之间需要很短的距离，这是一种验证细胞组分相互作用的工具。虽然不能通过测量距离来证明生物间的相互作用，烦恼将共定位精度提高到几纳米。蛋白质的二聚过程和构象变化也是该方法的目标[3.］．间接应用领域由烦恼生物传感器改变他们的烦恼与感知目标交互时的效率。一个非常突出的例子是用于探测钙的Cameleon生物传感器^{2 +}浓度变化[4］．

Förster半径R₀一对氟化物之间的距离是在哪里烦恼效率达到1 / 2(即50%)。通常，这个距离在20…60 Å(2…6nm)的范围内。Förster半径R₀视光物理参数而定烦恼对(5]:

与
卡巴²:方向因子
J(λ):重叠积分
N:折射率
问_D:给体量子产率

烦恼效率E随荧光剂之间距离的变化由下式表示:

与
R₀: Förster radius
r:供体-受体距离

如果Förster半径为给定烦恼对则知，对则测烦恼效率揭示了两个荧光染料之间的距离r。显然，测量是非常关键的，因为6^th权力涉及到效率对距离的依赖。反过来，所有的距离计算都不应该被夸大。然而,测量烦恼活样本的效率变化可以直接指示相互作用、运输现象和其他细胞事件的变化。

在活细胞中，染料的选择通常是绿色荧光蛋白变体，而在固定制剂中使用的染料范围从抗体标记染料到绿色荧光蛋白两者的变体或组合。图2显示了两个常用的烦恼对。有更多的选择，随着新染料和荧光蛋白的日益增多，这个领域变得越来越拥挤。光谱性质相似的染料是可互换的，各种排列都是可能的。

最直接的测量方法烦恼效果是烦恼- ap的方法。这是要展示的样品烦恼为供体成像。在前面的例子中，这是指蓝色激发和收集绿色发射的实验。在收集图像后，感兴趣的区域会被光漂白受体(即“AP”，受体光漂白)的光强烈照射，但不会损伤供体。然后，拍摄捐赠者的第二张照片。如果有的话烦恼，供体应该在漂白区域显示增加的强度，因为有更多的分子准备供供体荧光，而不是排到烦恼通道。的烦恼效率E由下式估计:

withDA:漂白前的供体强度dommega:漂白后的供体强度AP方法被限制于固定的样本，因为图像是连续拍摄的。这需要时间，活的样本会发生结构上的变化或移走。一种改进活样本实验结果的方法被称为烦恼-SE，表示“敏化”发射。敏化是指受体分子在给体激发时立即开始发射烦恼是可能的。该方法同时采集所有荧光通道。根据之前收集到的校正因子，烦恼图像是由不同的并行图像计算出来的。虽然这种方法可以检查有生命的材料，但校正容易产生误差，而且需要非常细致的实验才能得到可靠的结果[1，5］．

除了测量强度的变化，测量荧光寿命也可以揭示烦恼发生。施主的激发态通过发射光子回到基态而衰减。如果没有烦恼发生时，荧光寿命描述了这些单路径衰减动力学。如果激发态也能衰变成烦恼通道，寿命缩短，因为有第二个选项加速激发态的清除。测量改变的寿命和提取的动力学贡献也允许估计烦恼效率。这种方法被称为“这部电影-烦恼“(6］．