有针对性的基因表达在成年小鼠中枢神经系统组织

视网膜部分做准备。整个眼睛的n = 3 C57BL / 6成人(两个月)小鼠解剖,flash冻结在组织冷冻剂和储存在-80°C。部分(15µm)准备与徕卡CM1850UV低温恒温器,放置在徕卡PEN-membrane幻灯片。部分被固定在寒冷的75%乙醇(2分钟),洗两次RNAse-free水(30秒),在梅尔的苏木精染色(1分钟),可视化三核层:视网膜神经节细胞层(GCL),内部核层(INL)和外核层(筒)(图1)。部分在RNAse-free然后洗水(2 x 30秒),在分级脱水乙醇系列和风干(15分钟)。

中国大陆的过程。LCM执行与徕卡LMD6500 microdissector使用5 x客观与TL-BF brighfield对比方法。激光参数用于解剖:60,孔径7,速度7,标本平衡46和抵消25。视网膜层是microdissected使用铅笔函数边界每个单层按照以下顺序:GCL, INL和辊筒。图1显示了用于GCL解剖和轮廓图1 b用于辊筒解剖。

RNA提取中存在的分析。Microdissected层来源于500年3动物收集和集中µL管。从每个池总RNA提取使用Nucleospin XS RNA列(Macherey-Nagel)模块分析根据制造商的说明。数量和质量的RNA进行评估测量OD在260 nm, 260/280和260/230比例的Nanodrop (Celbio)。我们为每个池获得以下收益:GCL 150 ng, INL和辊筒450 ng。

测试精度microdissecting单一层我们执行中存在分析的视紫红质表达,蛋白质参与phototransduction特别表现在光感受器,其原子核位于筒(刘et al ., 2004年,细胞组织Res 315: 197 - 201)。总RNA逆转录进行150 ng的使用上标很互补脱氧核糖核酸合成装备(表达载体),根据制造商的指示。PCR进行10 ng cDNA Rotor-Gene 6000 (Corbett)使用KAPA SYBR快速普遍qPCR工具包(Resnova),下列条件:95°C 5分钟紧随其后40周期(95°C 15秒,60°C 20秒,72°C 40秒)。融化曲线坡道从55°C到95°C 0.2度/秒。视紫红质mRNA的相对水平正常化的核糖体蛋白基因L41 (Tripathi et al ., 2009年,159年神经科学:842 - 849)。所有引物对显示单一的山峰在融化曲线分析。

引物如下:

视紫红质(NM_145383.1):

• 5 'gcctgaggtcaacaacgaat3 ',
• 反向5 'gataaccatgcgggtgactt3”

L41 (NM_018860):

• 5 'ggttctccctttctcccttg3 ',
• 反向5 'gcaccccgactcttagtgaa3”

正如预期的那样,视紫红质表达式只发现在辊筒,从而确认激光显微解剖的特异性和提取的rna的纯度(图1 c)。

大脑切片。成人(3 - 5月)老鼠的大脑进行解剖,立即在干冰冷冻和储存在-80°C到使用。在切割之前,大脑一直在一夜之间在-20°C,然后可以适应在-16°C徕卡CM1850UV低温恒温器1小时。(25µm)日冕部分被剪掉了整个的背侧海马和安装到徕卡PEN-membrane幻灯片。被小心地避免在温度快速变化以减少冷凝形成滑动,因此减少潜在的核糖核酸酶的活动。切割后,幻灯片是存储在一个密封的盒子,储存在-20°C。

中国大陆的过程。幻灯片慢慢加热到室温,被允许干~ 30分钟。幻灯片被固定为70%乙醇(RNAse-free水)1分钟,清洗1分钟去除RNAse-free水10月,简单冲洗在70%乙醇(RNAse-free水)和允许干完全~ 1小时(不完全干燥导致质量差激光切割)。背侧海马的CA1和CA3亚区解剖使用徕卡的“画和削减”功能LMD6500 microdissector和收集管帽(图2所示模拟)。10倍目标与TL-BF对比使用。激光参数用于解剖:60,孔径12日速度10,标本40平衡45和抵消。提高切割质量和准确性的凹边区域的解剖是减少第一次阻止其余组织脱落的焦平面。从每个次区域组织解剖的总量是CA1: 3.1±0.3毫米³,CA3: 3.8±0.4毫米³(大约75部分对应的大脑)。

RNA提取和基因微阵列分析。总RNA提取每个池CA1和CA3组织使用试剂盒AllPrep RNA /蛋白质包模块样品根据协议。的意思是RNA收益率CA1和CA3 425±51和616±96 ng /大脑,分别。分析RNA的完整性进行了使用2100生物分析仪(安捷伦)RNA完整性(RIN)数量为5.4±0.6,5.2±0.2分别为CA1和CA3记录。老鼠基因表达阵列(安捷伦4 x44k幻灯片)与探针杂交获得提取的rna。微阵列数据分析与安捷伦GeneSpring GX软件和基因本体使用大卫执行功能annotational工具(黄等。2009年,自然Protoc 4: 44-57)。显著调节基因在许多生物过程观察(图2 e)。图2 f显示表达式的热图与钾离子运输相关的基因,其中一个生物过程在CA1和CA3显著监管。