学习如何除去你的自体荧光共焦图像

荧光显微镜已经彻底改变了我们对生物学的理解。细胞内定位特定分子事件的能力与高空间分辨率,我们得以洞悉从基因表达途径,药物的相互作用。

随着现代技术的共焦显微镜已经改善,灵敏度也增加。与任何敏感的测量,信号噪声比,一个根本问题,背景噪音可以模糊的小信号的变化。

在荧光共焦显微镜,噪音是自发荧光的最大来源之一。删除此背景下能够理解至关重要的小信号的差异存在在一个样本。在本文中,我们将探索如何删除与一些快速修复自体荧光和荧光寿命成像等现代技术的帮助下变得更容易使用软件和显微镜硬件的进步。

自体荧光有许多潜在的原因和通常可以有多个源在一个样本。首先,细胞制剂本身可以内生自发荧光的来源。一些常见的来源是NADH、黄素、脂褐质胶原蛋白和弹性蛋白,以及叶绿素和木质素在植物样品。换句话说,他们是很难摆脱的。

自发荧光的细胞增加,样品前处理的方法成像会引入额外的背景荧光。这可以是任何东西,从药物治疗越来越多的媒体。定位是很重要的自体荧光的来源在试图删除它。

知道你的样品

如果你经验自发荧光的问题,首先要做的是尝试和隔离的原因调查样本。当你开始你的实验中,运行一个标记控制来确定是否有贡献的背景荧光染色过程。

同样重要的是知道你的自体荧光光谱。这可以决定使用光谱λ扫描。与实验光谱扫描有助于优化和避免自体荧光的强劲山峰。

优化荧光团

一旦你有了一个好主意你的自体荧光光谱,下一阶段是优化你的荧光团的选择。如果自体荧光光谱和荧光团重叠密切那么极有可能你的信号将会掩盖自体荧光。在这种情况下,选择一个荧光团与自体荧光光谱远离你的背景。例如,如果您的自体荧光光谱的蓝色区域,移动你的绿色或红色荧光团。

选择荧光团时,选择一个Alexa萤石等现代探测Dylight或阿。这些染料往往更明亮、更稳定和更窄的激发和发射乐队,使其更容易从你的荧光团只选择信号。如果你的显微镜可以检测到它们,红色染料避免自体荧光的问题是一个很好的方法,因为这些波长很少发现在生物样本。能够检测到红色染料有野猪的能够扩大渠道的数量可以用于多色实验。

荧光团的选择,重要的是不要盲目运行实验浓度在管上市。往往,萤石的滴定phore将是必要的,在样本测试不同浓度。这个低点你看到从你的背景浓度给你最好的分化和最低的自体荧光。使用制造商的指令作为指导和创建一个稀释系列荧光团的覆盖范围略低于和略高于推荐使用。测试这些稀释对贵公司提供的样品,这将给你最有用的信号。

优化你的显微镜设置

设置你的共焦显微镜中发挥巨大的作用在你的图像信号是可见的,包括自体荧光。使用这些设置你的优势减少尽可能多的自发荧光信号的通过调整光谱检测。有不同的方法可以做到这一点取决于显微镜,但最灵活的选择是选择一个白光激光耦合用光谱探测器。这意味着您可以精确调整波长的光到达样本以及波长穿过探测器。这样可以很好的控制在选择信号记录在捕获的图像,并提供充足的机会来消除自体荧光。

治疗你的样品以避免自体荧光

自体荧光经常不是来自示例,但从它之前被成像。例如,越来越多的媒体,媒体组织培养和实验室塑料都可以自发荧光的来源。

如果您正在运行live-cell成像实验,然后再考虑用预热苯酚取代正常培养基red-free介质成像之前或一个清晰的缓冲盐溶液。除了酸碱指示剂酚红,这是高度兴奋时荧光在440 nm,培养基和补品的边后卫可以包含许多蛋白质和小分子的荧光信号拥有所有的加起来是一个强大的自发荧光背景如果不删除。如果你决定将你的细胞实时成像的新型媒介,重要的是要注意,这可能会导致意想不到的细胞行为和表型的变化,这取决于你学习你可能需要首先细胞适应新媒体。

值得测量自发荧光成像的菜肴你使用相同的显微镜设置,看看这是一个自发荧光的来源。如果是,试着成像使用文化与玻璃窗和玻璃底菜菜特别设计的删除
自发荧光信号。

类似的问题还可以看到当成像活检和组织样本暴露于化学物质。一个常见的例子是消化道,会有大量的自发荧光如果暴露于抗生素,如四环素,有强烈荧光的签名。在这种情况下,荧光容易被彻底冲洗缓冲盐水或溶剂的谨慎使用。

如果你是修复细胞,固定自体荧光的方法可以有很大的影响。考虑替代福尔马林和戊二醛,尽量不要存储固定样本成像前太久,因为自体荧光可以增加。

软件

而忽略自发荧光通过实验设计是最优的,som时代这是不可能的。在这些情况下,可以计算你的自体荧光问题的解决办法。使用显微镜ImageJ等软件或开放源码解决方案,可以分析包含aut荧光的像素和尽量减去从整体形象[1]。当心,计算方法可能很复杂。有许多不同的方法和算法可供选择,所以这是一个好主意去尝试几看到它工作得很好。重要的是要记住,这些方法通常可以减少你的荧光团的强度信号以及自体荧光,所以请谨慎使用,请注意,通常会有增加之间的权衡与bac地面和减少你的信号强度。

删除后自体荧光固定

一旦你有你的样品制备和储存在冰箱里,它就像是任何自发荧光有留下来。而更容易消除自发荧光的样品制备阶段,当然有可以采取步骤,即使在后期。

有许多化学治疗可以减弱自发荧光信号。有些商业化,而其他人则可以很容易地准备使用公共实验室化学物质这样的硼氢化钠,苏丹黑B、乙醇铵等。(2、3)。

光漂白往往在显微镜有消极的含义,与失去你的荧光信号在花了很长时间寻找最好的图像与激光出现有点太高了。然而,对于自体荧光,漂白可以成为你的朋友。添加荧光团之前,你可以把你的样品高强度LED光漂白的自发荧光背景。之后,你选择的荧光团应该对比更强烈反对漂白的背景[4]。

与自体荧光显微镜和荧光团技术不断前进。有两个创新之处是在商业共焦显微镜中变得更容易。

白光激光器

白光激光器(将)提供了很大的灵活性时减少自发荧光。首先,他们使您可以很好地调整你的激发波长来匹配您选择的荧光团,同时补充自发荧光的样品。

白光激光器也给你最大的灵活性时,荧光团的选择,从理论上他们可以给你的能力与所有已知的荧光染料的光谱。与波长从440纳米到红光对于结束(790海里),激动人心的现代的能力远远红色荧光团时特别有利的处理自体荧光,哪个更常见的蓝色和绿色带谱。

最后,但并非最不重要的是,将光纤技术实现脉冲激励,这样你可以记录荧光信号(光子计数)非常短的脉冲之间的时间间隔。这是一个基本要求time-correlated单光子计数(TCSPC)——黄金标准为荧光寿命分析方法。与你的能力,这部电影可以植入你的显微镜设置中,提供一种非常有效和减少自发荧光的相对简单的方法,提高图像对比度。

一生中成像

荧光寿命成像方法可以用于消除自体荧光。而不是仅仅依靠在一个给定的波长,荧光强度寿命测量反映了荧光团的时间花在激发态,通常的纳秒。这是非常有用的,因为你的背景自发荧光和荧光团的机会有重叠光谱相对较高。然而,他们拥有相同的生命周期信号的可能性要小得多。这意味着一生的测量可以用来区分自体荧光和荧光团的信号,即使他们似乎在同一光谱范围。以这种方式能够区分荧光信号意味着使用寿命测量可以从几乎任何荧光信号收集有意义的信息,甚至自发荧光。而一生测量一直是一个相对复杂的技术,改善硬件和软件都是使其更容易融入任何共焦显微镜工作流。

自体荧光没有毁了你的实验。

当你只有一个有限数目的珍贵的样本,是至关重要的任何妥协的质量你的实验数据。自体荧光是一种常见的发生,如果你让它毁了你的实验。然而,有许多解决方案,从简单的自发荧光转换你的样品使用的媒体一直到先进的显微镜和探测器的使用。

正在准备自发荧光的最好方法是阻止它影响你的实验。通过做好准备可以做出选择的实验设计,减少或完全消除背景荧光。