荧光作为显微镜中的工具
荧光在显微镜中被广泛应用，是观察特定分子分布的重要工具。细胞中的大多数分子不发出荧光。因此，它们必须用荧光分子标记，这种荧光分子被称为荧光色素。感兴趣的分子可以直接标记(例如用DAPI标记DNA)，也可以用与特定抗体偶联的荧光染料对它们进行免疫染色。细胞固定通常是免疫染色所必需的。
荧光显微镜还可以对活细胞或组织进行延时成像。为此目的，可以用基因编码的荧光分子标记感兴趣的蛋白质绿色荧光蛋白(绿色荧光蛋白)。感兴趣的分子(如Ca2 +)也可以使用可逆结合的合成染料(例如fura-2)或转基因的自然存在的蛋白质(例如。绿色荧光蛋白衍生物)。
电子能态的变化导致发光
发光描述了由电子从激发态转变为能量较低的态所引起的发光效应的发生。电子可以以不同的能态存在。基态是电子非常稳定的状态，具有最低的能级。如果电子吸收能量，它们可以被提升到更高的能级，即激发态。由于激发态的能量高于基态，当电子回到基态时，必须释放能量。这种能量可以以发射光子的形式释放出来。
发光有几种形式，不同的是系统被激发的方式，例如，在电致发光中，系统是通过电流被激发的，化学发光是由于化学反应发生的，光致发光是由光子激发产生的。
光致发光又可分为荧光和磷光两个亚群。荧光和磷光的主要区别是它们发光的持续时间。当照明停止时，荧光立即结束。相反，磷光在激发结束后可以持续数小时。
荧光机理
荧光染料只有在相应波长的光照射下才会发出荧光。波长取决于荧光团的吸收光谱，必须确保传递适当数量的能量以将电子提升到激发态。电子被激发后，它们只能在这种高能态中停留很短的时间。当电子弛豫到基态或另一能级较低的态时，能量以光子的形式释放出来。由于在这一过程中损失了一些能量，与吸收的光相比，荧光色素发出的光具有增加的波长和较低的能量。
磷光的机理
由于磷化分子的发光时间比荧光染料长得多，因此它们储存激发能的方式一定有所不同。这种差异的基础是在两种形式的激发态中发现的，单线态激发态和三线态激发态，它们基于不同的自旋取向。
自旋是电子的一种属性。用简化的术语来说，自旋描述了由电子旋转引起的角动量。电子自旋的方向可以是正的(+1/2)或负的(-1/2)。能级较高的自旋对可以是平行的，也可以是反平行的。在反平行自旋对中，各个角动量相互补偿，总自旋值为零。这种自旋对齐被称为单线态。两个平行自旋不补偿，得到的值不等于零。在这种情况下，自旋被称为处于三重态。
当电子从单线态激发态回到基态时，就会发生荧光。但在某些分子中，被激发电子的自旋可以在称为系统间交叉的过程中切换到三态。这些电子失去能量，直到它们处于三态基态。这种状态的能量比基态高，但也比单线态激发态低。因此，电子不能切换回单线态，也不能轻易回到基态，因为量子力学只允许总自旋为零。因此分子被困在它们的能量状态中。
但是从三重态基态到基态的一些变化一次是可能的。这些变化引起光子的发射和磷光。由于一次只可能发生少数事件，三态基态呈现出一种能量库，使磷光在较长时间内成为可能。
显微学中的发光
对显微镜来说，荧光是最有用的一种发光。荧光色素可以很容易地通过特定光源(例如灯和滤光系统或激光)用特定波长激发，并且发射的光可以通过波长(斯托克斯位移)与激发光区分开来。
使用荧光成像，实验人员可以描述细胞内分子的数量和定位。荧光显微镜的另一个优点是可以同时使用几种荧光色素。荧光染料只需要改变激发波长和发射波长。因此，可以同时观察不同的目标分子，允许进行大量的实验，例如共定位研究。
