荧光染料

在荧光显微镜中，有两种方法可以想象您的蛋白质。借助于内在荧光信号的帮助 - 这意味着通过克隆并因此将荧光蛋白与靶蛋白遗传地连接到靶蛋白。或者借助于荧光标记的抗体，其特异性地结合到感兴趣的蛋白质。对于一些生物学问题，执行后者更有用甚至是必要的。例如，在组织学样品的情况下，例如，由于通常，不可能使用荧光蛋白，所以样本衍生自未容纳任何荧光蛋白的生物体。此外，如果功能性抗体可用，免疫荧光比荧光蛋白技术要快得多，您必须克隆感兴趣的基因并将DNA转染到足够的细胞中。荧光蛋白的另一个缺点在于它们本身的性质。用它，它们在细胞内具有特定的蛋白质特性，这可能导致关于感兴趣的附带蛋白质的功能障碍或误解。然而，应该认为使用荧光蛋白通常是观看活细胞的选择方法。

免疫荧光利用抗体对其抗原的非常特异的结合亲和力。这可能有两种不同的外观。最简单的方法是使用一种荧光标记抗体，该抗体与感兴趣的蛋白质结合。这叫做直接免疫荧光．

在大多数情况下，使用两种形式的抗体。第一个与目标蛋白结合，并且自身没有荧光标记（1）^圣抗体）。但是第二个（2^nd抗体），其结合1^圣抗体特异性携带荧光染料。这种方法称为间接免疫荧光它有几个优点。一方面，这是一个放大效应，因为不止一个2^nd抗体与1结合^圣抗体。另一方面，不必总是用荧光染料标记针对你喜欢的蛋白质的抗体，而是使用商用荧光标记2^nd抗体。广泛使用的免疫荧光荧光染料是FITC、TRITC或几种Alexa Fluor^®以下提到的染料。

一种染料，通常与染料同时使用FITC是其相似的发声伙伴TRITC（四甲基罗丹明-5-（和6）-异硫氰酸酯）。与FITC， TRITC不是荧光素，而是荧光素的衍生物若丹明家庭。罗丹明也有一个很大的共轭芳香电子系统，这导致了它们的荧光行为。相比FITC， TRITC (479 g/mol)被绿色光谱中的光激发，在550 nm处最大。其最大发射波长为573 nm。与蛋白质(如抗体)的结合也是基于反应性异硫氰酸酯基团。

即使FITC和TRITC仍在使用，它们是相当弱的荧光染料，不推荐在最先进的显微镜下使用。他们的利润是以经济价格为基础的。

这一相对较小的荧光染料集合来自于花菁，这也是它们名字的起源:Cy2那Cy3那Cy5和Cy7. 它们都可以通过反应基团与核酸或蛋白质连接。例如，对于蛋白质标记，使用马来酰亚胺基团。有趣的是，关于荧光，Cy5对其电子环境很敏感。这可用于酶的测量。附着蛋白的构象变化导致荧光发射的正或负变化。此外，Cy3和Cy5可用于烦恼实验。菁染料是比较古老的荧光染料，是其他荧光染料的基础，具有更高的亮度、光稳定性、量子产率等。

在荧光显微镜中，不仅蛋白质结构值得研究，而且核酸也值得研究。有时有必要通过检测细胞核来确定细胞的确切位置或数量。最常见的DNA染色之一是大皮（4'，6-二氨基-2-苯基吲哚），与DNA双螺旋富含A-T的区域结合。与未结合态相比，DAPI与DNA结合时荧光强度增加。它因紫外线-最大波长为358 nm的光。发射光谱宽，峰值为461nm。弱荧光也可检测到RNA结合。在这种情况下，发射移到500纳米。有趣的是，DAPI能够渗透完整的质膜。因此，它可以用于固定细胞，也可以用于活细胞。

第二次广泛使用的DNA染色选项是Hoechst染料的家族，最初由化学公司Hoechst AG生产​​。188金宝搏怎么注册赫斯特33258那赫斯特33342,赫斯特34580是双苯甲酰亚胺，具有插入A-T丰富区域的倾向，因此后者不经常使用。类似于DAPI，它们被激发紫外线-在未绑定条件下，光和光的最大发射波长为455nm，移动到510–540nm。Hoechst染色剂也具有细胞渗透性，因此可用于固定细胞和活细胞。与DAPI不同的是它们的毒性较低。

膜不可渗透的DNA染色是碘化丙啶在细胞培养中，由于不能进入完整的细胞，它通常用于区分活细胞和死细胞。碘化丙啶也是一种插层剂，但对不同的碱基没有结合偏好。在核酸结合状态下，其最大激发波长为538 nm。最大发射波长为617 nm。未结合的碘化丙啶碘化铀的激发和发射最大值被转移到较低的波长和强度。它也可以在不改变其荧光特性的情况下与RNA结合。要区分DNA和RNA，必须使用足够的核酸酶。

一种无需事先操作就能在DNA和RNA之间产生差异的染料被称为吖啶橙色．它的激发/发射对在DNA结合态为502 nm/525 nm，在RNA结合态为460 nm/650 nm。此外，它还能进入酸性室，如溶酶体。在那里阳离子染料被质子化了。在酸性环境中，吖啶橙被蓝色光谱中的光激发，而橙色区域的辐射最强。因为凋亡细胞有很多被吞噬的酸性隔间，这使得它成为这些类型细胞的常用标记物。

在神经元研究中，例如基因活性或细胞运动，了解细胞的离子浓度是很有意义的。钠、钙、氯或镁离子对许多不同的细胞活动有深刻的影响。通常，离子可以在荧光标记螯合剂的帮助下被捕获，当与适当的离子结合时，螯合剂改变了它们的光谱性质。这道德原则是实现在钙指标Fura-2，Indo-1，Fluo-3，Fluo-4和钙绿色例如

对于钠检测，SBFI(sodium-binding benzofurzanisophthalate)或钠绿是常用的。PBFI(与钾结合的苯并呋喃异酞酸盐)检测钾离子。

有趣的是，还有以蛋白质为基础的钙指标。其中一种是基于水母的化学发光蛋白发光蛋白质．AEQUORIN，发光体共塞仑，分子氧和CA的相互作用^２＋导致释放蓝光 - 一个非常突出的机制发现荧光蛋白．

下表列出了上述所有染料。此外，还提到了其他荧光染料及其激发和发射波长峰。

• 荧光蛋白 - 引入和光谱特性
• 荧光蛋白与荧光计时器
• 现代荧光蛋白及其生物学应用
• 荧光蛋白-从起源到诺贝尔奖