Photoactivatable蛋白质
可光激活的蛋白质可以从一个低荧光状态到更高的荧光状态。通过在紫罗兰/蓝色光谱中应用一个短光脉冲，这个开关在不到一秒的时间内发生，并允许检测动态细胞过程。在感兴趣区域(ROI)的分子定向光激活可以用来监测这些活化蛋白在细胞内的运动。而在其他脉冲追踪实验中，比如收紧人们无法区分重新进入ROI的蛋白质和新合成的分子，光活化是绕过这个问题的一种方法。
第一个光激活蛋白是wtGFP变体，由Lippincott-Schwarz和Patterson创造。它包含一个单点突变(T203H)，导致在450 - 550 nm区域的吸光度很低。在紫光的帮助下被光激活，PA -绿色荧光蛋白(可光激活的绿色荧光蛋白)的最大吸收波长从400 nm切换到504 nm (s.图2)。因此，当波长为488 nm时，其荧光增加约100倍，这在激活和非激活蛋白之间形成了鲜明的对比[1]．
PA-活化的潜在过程绿色荧光蛋白似乎是在222残基中谷氨酸侧链的光诱导脱羧作用。二氧化碳的丢失使发色团的结构从中性变为阴离子态[2]．
这里应该提到的另一个候选人是Phamret(光激活介导的共振能量转移)，是一种特殊的串联二聚荧光蛋白，被光激活烦恼．phhamret是一种融合蛋白，由一个PA-组成绿色荧光蛋白与its共价结合烦恼森林有害生物控制的伴侣。暴露在458 nm波长下，ECFP在480nm处发射。邻光活化PA-绿色荧光蛋白用405 nm激光光束进行。在此之后，反复暴露在458纳米处导致烦恼激活ECFP和PA-之间的关系绿色荧光蛋白，产生绿色荧光。因此，“非活性”和“活性”形式可以被相同的激光波长激发(s.图3)。一个负特性可能是由两个荧光蛋白组成的蛋白质的大小，可能引发空间位阻问题。
Photoconvertible蛋白质
与光激活蛋白相比，光转换蛋白发出的荧光已经处于非转换状态。因此更容易定义你的投资回报率。在石质开阔的脑珊瑚中发现了光转换Trachyphyllia geoffroyi．由于它们的发射特性，经过光电转换后由绿色变为红色紫外线光，荧光蛋白被命名为枫像日本枫树的叶子[4]。在秋天，它们的颜色从绿色变成红色。如果Kaede在380 ~ 400 nm之间进行光转换，其最大发射波长从518 nm转移到582 nm。这显示出绿色和红色荧光之间的比例显著改变了2000倍。这种转化是不可逆的(见图4)。另一个限制因素是Kaede的四聚体特性，这使得它在活细胞成像研究中具有挑战性。FPs的寡聚化可能导致对感兴趣的标记蛋白(POI)的位置和行为的误解。聚集甚至可以完全抑制POI的正常功能。
光转换的基本过程也是光诱导的过程。在这种情况下，发色团内的组氨酸残基(His61-Tyr63-Gly64)被辐射裂解，最终形成高度共轭的双咪唑环体系。这一过程与荧光向红色波长的转移有关[2]．
一个红色到绿色的可转换FP来自珊瑚Dendronephtytha sp。它的名称和红色可激活属性反映在表达式中Dendra［5]．商业发展Dendra2是第一个红绿光转换蛋白单体。
另一种广泛使用的光学荧光剂是tdEosFP［6、8并主要被隔离于Labophyllia hemprichii，一种石珊瑚。串联二聚体在近紫外光照射后可以从绿色荧光转化为红色荧光，可以很好地用于超分辨率显微镜，对于单体的版本也是如此meo和mEos2．
在第三种石珊瑚中发现了一种与Keade非常相似的光转换蛋白:Favia黄癣．近紫外光照射后四聚体KikGR将它的荧光从绿色变成红色，但这两种颜色都比枫色亮得多。它的商业变种被称为Kikume并能被光转换多光子激发波长750纳米。像这样，它可以用于厚的组织标本。KikGR的诱变导致单体形式mKikGR．它与mEos2和Dendra2一起是超分辨率成像中常用的光学荧光剂。
Photoswitchable蛋白质
光激活是一种不可逆的从非荧光状态到荧光状态的转换，而可光开关的蛋白质能够在这两种条件之间切换［７］．在不同波长的光脉冲的帮助下，这些荧光蛋白可以在不需要的情况下开启和关闭数百次photo-bleaching．这种在荧光和暗态之间切换的现象被称为光致变色，并且已经出现在wtGFP的单分子水平上，尽管程度很低。
一种用于超分辨率显微镜的著名的可光转换蛋白质来自石珊瑚:Dronpa是一个单体,并吸收最大值503海里由于其阴离子,deprotonated发色团,和一个小吸收最大值390海里由于它的中立,质子化了的发色团(图5)。而阴离子形式排放最大值518海里,中性形式描绘了一个荧光状态。
此外，还存在与发色团质子化有关的顺反异构化。在发色团的中性状态下，Tyr66侧链呈反式构象(s.图6)。在阴离子状态下，Tyr66呈顺式构象。在405 nm激光脉冲辐照下，Dronpa被迫形成其荧光顺式构象。488纳米激光脉冲将Dronpa构象转换为非荧光反态。这个循环可以重复几百次。
一种四聚体可光开关蛋白，其发射最大值在红色区域火种FP(KFP1)。
最新的研究成果是一种结合了光转换和光开关这两种功能的蛋白质。IrisFP是一种wtEosFP衍生物，在绿色荧光和红色荧光构象中具有开和关开关状态。换句话说，在高强度405nm激光照射下，IrisFP由绿色转移到红色发射状态。Green IrisFP可以在488 nm激光的帮助下关闭。405纳米的低强度激光再次将其打开。另一方面，红色IrisFP用532 nm的激光关闭，并可以用440 nm的激光再次打开。单体形式的相邻结构mIrisFP为进一步申请打开大门[3.]．
其他特殊荧光蛋白
除了容易被光操纵的荧光蛋白外，还有其他可被其他触发器切换的蛋白质(s.图8)。例如，对活细胞的离子状态感兴趣的研究人员可以选择GCaMP作为一个Ca2＋指标。GCaMP根据其Ca改变其荧光行为2＋绑定。其他荧光蛋白如VSFP1用于检测膜电位，而黄色荧光蛋白YFP-H148Q对氯敏感-离子。此外，FPs的荧光特性随环境pH值的变化而变化。Superecliptic pHluorin(9),pHuji是两个例子。在它们的帮助下，可以追踪胞内和胞外分泌事件以及细胞内的分选事件。
随着时间的推移而改变其发射光谱的荧光蛋白被称为荧光计时器。这种行为不是pH值变化、离子强度或蛋白质浓度的结果，而是独立于这些生化参数发生的。换句话说，相关蛋白质的年龄可以通过其颜色来估计。有了这些特征，就有可能测量活细胞内的时间——以及取决于时间的事件。
第一个荧光定时器是由实验室描述谢尔盖a Lukyanov在2000年。这个叫DsRed的突变体英国《金融时报》(荧光计时器)将其发射光谱在18小时内从红色波长改变为绿色波长。因为FT是四聚体弗拉季斯拉夫•Verkhusha看到了创造一个单体的必要性。mCherry的诱变导致3个不同转化时间的荧光计时器(表1)。这些蛋白质在快、中或慢的时间尺度上从蓝色变为红色，但仍然太慢，无法测量在几分钟内发生的细胞过程。
然而，在荧光计时器的帮助下，可以在空间和时间分辨率上观察活细胞中蛋白质的行为。例如分化和细胞极化过程可以观察到。此外，蛋白质运输事件或病毒组装可以跟踪或基因活动可以监测。这个应用列表肯定可以扩展，并显示荧光计时器的潜在用途在未来。
表1:选定的光激活、光转换和光切换蛋白和荧光计时器
蛋白质 |
前女友马克斯(nm) |
新兴市场马克斯(nm) |
QY |
亮度 |
pK一个 |
结构 |
杂项 |
Photoactivatable |
激活条件 |
||||||
PA -绿色荧光蛋白 |
400 |
515 |
0．13 |
2．7 |
单体 |
紫罗兰色的 |
|
PAmCherry |
404 564 |
ND 595 |
ND ０．４６ |
8 |
6.3 |
单体 |
350 - 400 nm |
PATagRFP |
ND 562 |
ND 595 |
ND 0.38 |
ND 25.1 |
ND 5．3 |
单体 |
紫罗兰色的 |
PAmKate |
ND 586 |
ND 628 |
ND 0.18 |
ND 4．5 |
ND 5．6 |
405海里 |
|
Phamret (PA -绿色荧光蛋白森林有害生物控制+) |
458 |
475 |
0.40 |
13 |
单体 |
紫罗兰色的 |
|
Photoconvertible |
转换的条件 |
||||||
mClavGR2 |
488 566 |
504 583 |
0.77 0．53 |
14.6 17 |
8 7．3 |
单体 |
405海里 |
mMaple |
489 566 |
505 583 |
0.74 ０．５６ |
11．1 16．8 |
8．2 7．3 |
单体 |
380海里 |
Dendra2 |
490 |
507 |
0.50 |
22 |
6．6 |
单体 |
初始状态 |
PS-CFP2 |
400 490 |
468 511 |
0.2 0．23 |
8．6 10．8 |
单体 |
紫罗兰色的 |
|
Meos3.2 |
507 572 |
516 580 |
0．7 0．55 |
53 18 |
5．4 5．8 |
单体 |
405海里 |
枫 |
508 |
518 |
0.88 |
87 |
5．6 5．6 |
四聚物 |
初始状态 |
EosFP |
506 571 |
516 581 |
0．7 0．55 |
四聚物 |
|||
mEosFP |
505 569 |
516 581 |
0.64 0.62 |
单体 |
|||
mEos2 |
506 |
519 |
0.84 |
47 |
5．6 |
单体 |
初始状态 |
kikGR (Kikume) |
507 583 |
517 593 |
0．7 0.65 |
37.6 22.8 |
7．8 5．5 |
四聚物 |
365海里 |
PSmOrange |
548 636 |
565 662 |
0.51 0.28 |
58 9 |
6．2 5．6 |
单体 |
蓝绿色 |
PSmOrange2 |
546 619 |
561 651 |
０．６１ 0.38 |
31.1 7．2 |
6．6 5．4 |
单体 |
489海里 |
mKikGR |
505 |
515 |
0.69 |
34 |
ND |
单体 |
初始状态 |
Photoswitchable |
激活/淬火条件 |
||||||
mTFP0.7 |
453 |
488 |
0．5 |
单体 |
405 nm / 458 nm |
||
PDM1-4 |
503 |
517 |
405 nm / 488 nm |
||||
Dronpa |
503 |
518 |
0.85 |
80.8 |
5．0 |
单体 |
紫色/蓝色 |
Dronpa-2 |
489 |
515 |
0.28 |
单体 |
405 nm / 488 nm |
||
Dronpa-3 |
489 |
515 |
０．３３ |
单体 |
405 nm / 488 nm |
||
bsDronpa |
460 |
504 |
0．5 |
单体 |
405 nm / 488 nm |
||
Padron |
503 |
522 |
0.64 |
单体 |
503 nm / 405 nm |
||
Padron0.9 |
500 |
524 |
500 nm / 400 nm |
||||
Mut2Q |
496 |
507 |
0.28 |
单体 |
405 nm / 478 nm |
||
rsFastLime (DronpaV157G) |
496 |
518 |
0.77 |
单体 |
405 nm / 488 nm |
||
rsKame (DronpaV157L) |
503 |
518 |
0.86 |
||||
Dreiklang |
515 |
529 |
０．４１ |
34 |
7．2 |
单体 |
365nm / 405nm |
mGeos-M |
503 |
514 |
0.85 |
43.9 |
4.5 - 5 |
单体 |
405 nm / 488 nm |
EYQ1 |
510 |
524 |
0.72 |
单体 |
405 nm / 514 nm |
||
KFP1 |
590 |
600 |
0.07 |
四聚物 |
532 nm / 458 nm |
||
rsCherry |
572 |
610 |
0．02 |
单体 |
550 nm / 450 nm |
||
rsCherryRev |
572 |
608 |
0.005 |
单体 |
450 / 550 nm |
||
rsTagRFP |
567 |
585 |
0.11 |
单体 |
445 nm / 570 nm |
||
mApple |
568 |
592 |
０．４９ |
单体 |
480 nm / 570 nm |
||
asFP595 |
572 |
595 |
< 0.001 |
四聚物 |
569 nm / 450 nm |
||
火种FP (KFP1) |
580 |
600 |
0.07 |
4．1 |
ND |
四聚物 |
绿色/ 450 nm |
rseGFP |
493 |
510 |
0.36 |
16.9 |
6．5 |
单体 |
405 nm / 488 nm |
rseGFP2 |
478 |
503 |
0．3 |
18．4 |
5．8 |
单体 |
408 nm / 478 nm |
Photoconvertible / |
|||||||
IrisFP |
488 |
516 |
0.43 |
22 |
四聚物 |
||
mIrisFP |
486 |
516 |
0.54 |
25 |
5．4 |
单体 |
紫罗兰色(深绿色) |
荧光 |
过渡时间(小时) |
||||||
Slow-FT |
402 |
465 |
０．３５ |
12 |
2．6 |
单体 |
9.8 |
Medium-FT |
401 |
464 |
０．４１ |
18 |
2．7 |
单体 |
1．2 |
Fast-FT |
403 |
466 |
0.30 |
15 |
2．8 |
单体 |
0.25 |
mK-Go |
500 |
509 |
ND |
ND |
6．0 |
单体 |
10 |
前女友马克斯:激振最大值，Em马克斯:最大发射量，QY:量子产额，亮度由量子产额与摩尔消光系数的乘积除以1000计算
参考文献
- 本论文由Diaspro A, Testa I, Caorsi V, Mazza D, Vicidomini G, Barozzi S, Parazzoli D, Transidico P, Garrè M and Faretta M:利用双光子激发激光扫描显微镜对活细胞中pa-GFP进行4D光激活。
- Olesya V、Stepanenko O、Stepanenko V、Shcherbakova DM、Kuznetsova IM、Turoverov KK和Verkhusha VV:现代荧光蛋白:从发色团形成到新的细胞内应用。生物技术51(2011)313-327。
- Wu B, Piatkevich KD, Lionnet T, Singer RH和Verkhusha VV:研究基因表达、核定位和动力学的现代荧光蛋白和成像技术。CurrOpin细胞生物学23:3(2011)310-317。
- 一种基于紫外诱导荧光蛋白的绿色到红色光转换的光学标记物。美国国家科学研究院学报99:20(2002)12651-6。
- Gurskaya NG, Verkhusha VV, Shcheglov AS, Staroverov DB, Chepurnykh TV, Fradkov AF, Lukyanov S和Lukyanov KA。蓝光诱导的单体绿到红的光激活荧光蛋白的工程。Nat Biotechnol 24:4(2006) 461-5。2006年3月19日。
- 维登曼，伊万琴科，奥斯瓦尔德，施密特，Röcker C, Salih A, Spindler KD, Nienhaus GU。EosFP是一种荧光标记蛋白，具有紫外诱导的绿色到红色荧光转化。美国国家科学学会主办。101:45(2004) 15905 - 10。2004年10月25日。
- 周旭、林明志:可切换荧光蛋白:十年多彩的化学与激动人心的应用。Curr Opin Chem Biol 2013年8月;17(4): 682 - 690。
- Jörg Wiedenmann, Sergey Ivanchenko, Franz Oswald, Florian Schmitt, Carlheinz Röcker, Anya Salih, Klaus-Dieter Spindler，和G. Ulrich Nienhaus: EosFP，荧光标记蛋白与紫外线诱导的绿色到红色荧光转换
