荧光和量子点的基础和历史

在任何搜索引擎中键入短语“荧光的定义”，你会得到以下短语，或非常类似的东西;

由某些物质发出的可见或不可见的辐射，是由较短波长的入射辐射(如x射线或紫外光)引起的。

这个定义与什么相关荧光显微镜（图1）？“较短波长的入射辐射”是仅用于“激发”样品中的荧光团的光源。这种光可包括可见光谱，紫外线（紫外线)及红外线(红外）显微镜中的源极可以从汞或氙弧灯到激光。的荧光团(上述定义中的“某些物质”)是指具有特殊性质的化合物，它们可以在较低波长的光激发下重新发射较高波长的光/光子。

波长的基本单位是米，“波长”的定义是光波两个连续波峰或波谷之间的距离。波长的符号是希腊字母lambda (l)。通常在显微镜中使用的波长在纳米(nm)范围内，可见光谱在400到700 nm之间紫外线光谱低于400 nm红外光谱从700nm开始(图2)。

荧光团根据它们的激发和发射波长进行分类，通常以a的形式图显示最大峰值。荧光团在所谓的“基态”中是自然稳定的。当它们吸收一个光子(来自“较短波长”的光)时，光子的能量将荧光团的电子提升到一个能量更高的“激发态”。被激发的电子不会保持在这个状态，而是失去振动能量，并在返回基态时发射一个波长更长的光子。对于显微镜中使用的荧光团，从激发到返回地面需要0.5到20纳秒的时间。

荧光团激发和发射波长通常缩写为带有下标“ex”(激发)或“em”(发射;l_前女友或l_新兴市场)．

每个荧光团都有一个不同的最大激发和发射光谱，这一性质被用来区分不同的目标在同一个兴趣样本中。例如，使用荧光染色DAPI(4'，6-二氨基-2-苯基吲哚)和荧光标记的phalloidin来突出肌动蛋白的细胞骨架。

波兰物理学家Aleksander Jablonski（1898-1980）是第一个描述的周期之间的地面/激发/发射在一个三级能量图中，它被简单地称为“雅布隆斯基图”。1930年，他以“激发光波长变化对荧光光谱的影响”的论文获得华沙大学博士学位。1933年，他在《自然》杂志上发表了一篇论文(《染料中的反斯托克斯荧光效率》)，其中包含了雅布隆斯基图。这个简单而有效的荧光团行为的说明强调了从基态到激发态的激发，并通过发射一个更长波长的光子返回基态(图3)。

虽然图3是简化的雅布隆斯基图，但需要注意的是，荧光团可以存在于许多不同的激发和发射状态。此外，荧光团可能通过不同的弛豫状态返回地面，这种弛豫状态被称为“三重态规定“这取决于分子的电子自旋。

乔治·加布里埃尔·斯托克斯爵士(1819-1903)是爱尔兰数学家和物理学家，在他的一生中，他在光学和光领域取得了许多发现和进展。1849年，他被任命为剑桥彭布罗克学院的卢卡斯数学教授，直到1903年去世。他在1852年发表了一篇名为《论光的可折射率的变化》的精彩论文[1]．这篇文章中使用的语言不同于我们在现代科学文献中使用的语言。以下是斯托克斯精彩语言的两段摘录;

“在去年秋天,当赛季迟到但很少提供机会观察,我学会了从不同来源的黄色玻璃已提到拥有如此之高的一个程度的财产内部分散与氧化铀的。”

和:

当管子被插入到看不见的光线中时，立刻就亮了起来，这的确是一幅奇妙的景象黑暗中可见．总而言之，这种现象有一种超凡脱俗的样子。”

“斯托克斯位移”后来以他的名字命名。当被激发的电子返回基态并发出光子时，其波长总是比用来激发荧光团的波长长。这是由于光的性质，波长与辐射能量成反比。的斯托克斯位移描述了荧光团的峰值激发波长和峰值发射波长之间(以纳米为单位)的差异(图4)。

区分荧光团的激发和发射之间的激发和排放在斯托克斯偏移的增加方面比例地更容易。荧光团在其斯托克斯偏移方面具有独特的特征，这是由于它们的电子配置和分子结构。

是斯托克斯第一次使用“荧光”一词来描述他观察到的现象，但其历史可以追溯到1565年。一位名叫尼古拉斯·莫纳德斯的西班牙内科医生和植物学家描述了一种奇怪的蓝色，这种蓝色来自墨西哥的树木，木材nephriticum．尽管这些早期观察结果，但在400年后，在生物体中报道了绿色荧光物质。1955年，达文波特和尼罗尔发表了一篇论文［2］描述了已知的水母子类嗜酸性粒细胞的镜粒细胞Hydromedusae.．当时，这项工作的作者并没有意识到嗜酸性粒细胞中含有绿色荧光蛋白（绿色荧光蛋白)．

直到1962年，下村修(1928)才发表了一篇论文［3］它的上镜成分被认为是一种蛋白质。他们与他在普林斯顿大学的教授(弗兰克·约翰逊)合作，从生物发光水母中收集样本Aequorea victoria．它们具有将荧光蛋白与水母分离的独特方式，即通过棉袋挤压分离的生物发光组织以产生溶液，其呼叫“挤压”。

1994年，哥伦比亚大学的Martin Chalfie(*1947)教授汇编了一篇论文，证明了基因编码绿色荧光蛋白可以在原核和真核细胞中功能性表达(即大肠杆菌以及秀丽隐杆线虫）［4］．本文说：“因为这种荧光不需要外源性底物和辅因子，绿色荧光蛋白表达可用于监测生物体中的基因表达和蛋白质定位。“这是该出版物，为广泛使用铺平了道路绿色荧光蛋白在生物研究。

一年后，加州大学圣地亚哥分校(University of california, San Diego)的钱永康(Roger Tsien, 1952-2016)教授(他一直在研究野生型的突变体)绿色荧光蛋白)在《自然》杂志的科学通讯中发表了他的作品［5］．这种发现单点突变（S65T）由Tsien及其同事选择，因为它具有最长的激励和发射波长（490/510nm），使其使其更加光稳定并且导致众所周知的绿色荧光蛋白激发/发射峰。

2008年，Shimomura, Tsien和Chalfie共同被授予诺贝尔奖在化学中的作用和发现绿色荧光蛋白．当下村发表诺贝尔奖演讲时他说:“当我发现绿色荧光蛋白1979年，我以为我已经做了我能做的一切绿色荧光蛋白，并决定终止我的工作绿色荧光蛋白为了集中精力研究生物发光”。他接着承认“绿色荧光蛋白是一种美丽的蛋白质，但在被发现后的30年里它都毫无用处。”

自从钱永健的发现以来，他的实验室已经设计了许多变种绿色荧光蛋白它覆盖了大部分可见光谱，并确实彻底改变了光学显微镜和成像领域。多亏了这种基因工程，绿色荧光蛋白有多种颜色可供选择，从光谱的蓝色部分(EBFP;380/460 nm)到光谱的黄色部分(YFP;514/527 nm)。

除了成像领域外，荧光团还可以作为“报告者”来研究细胞和生物体中的基因表达。荧光素酶，还有基因编码绿色荧光蛋白这些方法通常用于检查特定基因是否由细胞表达。用转基因病毒DNA或质粒转染生物体或细胞，当靶基因表达时，质粒发出荧光。然后，细胞内感兴趣的细胞器或部位可以在转染细胞中被可视化和检查。

用荧光团标记(或“标记”)的抗体通常称为“荧光探针"．在广泛使用之前绿色荧光蛋白其他的荧光团紧随它的发现，两个最常用的荧光团用来标记抗体FITC(异硫氰酸荧光素)和TRITC(异硫氰酸四甲基罗丹明)。虽然FITC和TRITC仍在使用，这一领域已经取得了重大进展，至少可以说，荧光团和探针的选择是广泛的。

当然，实验室中使用的最广泛的荧光团之一是“Alexa Fluor”染料。目前Alexa Fluor染料的范围涵盖了可见光谱，激发波长从346到784 nm。

1981年，俄罗斯科学家阿列克谢·艾基莫夫(Alexey ekkimov)在圣彼得堡瓦维洛夫国家光学研究所工作时，在玻璃基体中首次发现了量子点(或称Qdots)。然而，第一个量子点的胶体溶液是由路易斯·布鲁斯发现的，他在新泽西州的AT&T贝尔实验室从事半导体研究。他现在是哥伦比亚大学的化学教授。在1983年和1984年发表的两篇论文中，Brus将Qdots描述为“小型半导体晶体”。

量子点以一种特殊的方式表现——尽管它们只包含100到10万个原子，但它们表现出的特性就好像它们是由单个原子组成的。然而，它们确实符合荧光团的特性，即它们可以吸收光能，被激发并在返回基态时释放光子。但它们发出的光的波长取决于量子点的大小——量子点越小，发射波长越短。这种特性是由于更小的量子点具有更大的“最小带隙”。这是将一个电子激发到更高能级所需要的能量。由于更小的量子点激发需要更多的能量，它们随后发射出更低波长的光(波长与激发能量成反比)。

这是2002年近20年后，当Qdo​​ts商业上可供加利福尼亚州Quantum Dot Corporation的生命科学研究人员商购。

量子点是非常明亮和稳定的工具，用于荧光应用。研究表明，Qdots比传统的荧光团亮几个数量级，尽管与有机染料相比，它们的确切亮度存在一些差异［6］．在光稳定性方面，有报道称Qdots的稳定性是传统荧光团的100倍在活的有机体内成像研究，他们保持荧光长达四个月［7］．

在传统的荧光探针中，一个或多个荧光团可以附着在感兴趣的单个抗体上。然而，由于Qdots的表面积非常大，许多分子和抗体可以附着在一个点上，这可以有很多优点，包括荧光信号的放大。Qdots的使用在多种分析中也提供了一个优势，在其中各种波长可以同时成像。在这样的分析中，唯一的变量是研究人员选择的量子点的大小(以及发射波长)。激发范围广泛的Qdots可以执行与白光同时，这否定了使用多个激光器和许多调整，以形成最终的图像。

1. 论光的可折性的变化G. G.斯托克斯，硕士，F. R. S.菲尔。反式。r . Soc。1852年1月1日出版;http://rstl.royalsocietypublishing.org/content/142/463.full.pdf+html
2. 达文波特水螅水母的发光研究J. A. C. Nicol, 1955年11月29日出版。DOI: 10.1098 / rspb.1955.0066;http://rspb.reyalsocietypublishing.org/content/144/916/399
3. Aequorea，Aequorea，Aequorea，Aequorea的萃取，纯化和性质，一种生物发光蛋白。J Cell Comp Physiol。1962年6月59：223-39;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13911999?dopt=Abstract
4. 绿色荧光蛋白作为基因表达的标记;科学1994年2月11日：卷。263，第5148号，第81,148号DOI：10.1126 / Science.8303295;http://www.sciencemag.org/content/263/5148/802?ijkey=e60d69b507876bb025397e40e06389c288d2e92e&keytype2=tf_ipsecsha
5. 改善绿色荧光;自然卷373,23。1995年2月;http://www.tsienlab.ucsd.edu/Publications/Heim%201995%20Nature%20-%20Improved%20GFP.PDF
6. QDs与Alexa:免疫细胞化学有前景的工具的现实;纳米生物杂志》;http://www.jnanobiotechnology.com/content/7/1/4
7. 小鼠中量子点的非侵入性成像;Bioconjugate化学。， 2004, 15 (1)， pp 79-86 DOI: 10.1021/bc034153y;出版日期(网络):2003年12月30日;http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bc034153y