发光过程
一些非常常见的生物化学或生物化学实验室方法基于存在几种“......柔性”，例如磷光，化学发光，生物发光和最终荧光。作为对主题的介绍荧光蛋白学会更多关于“......柔佛”可能有用。这些现象的起源位于拉丁文词中：-escentia，这已经暗示了我们与视觉系统的联系。所有的“精华”都描述了我们可以用眼睛感知的物理、化学或生物过程。我们在表示改变、行动或过程的词后面加上后缀“…冷暖”，比如“康复”这个词。
所以很明显，荧光是我们可以看到的和变化或过程有关的东西。以后我们将了解荧光是如何满足这些条件的。首先，我们将简短地看一下其他的“…escences”，它们都是发光本身．发光是发射光的仿制术语，这不是高温的影响。因此，发光可以确定为寒冷的身体辐射的外观。该辐射可以是化学反应的一部分或晶体上的亚涂层运动或胁迫的原因。产生排放的另一种方法是炽热当物质作为热量发出的光线（例如热金属）。
化学发光是基于化学反应的发光过程，其中产物具有激发中间体。该中间体在落入地面时发光。与荧光不同，化学发光材料中的电子通过化学反应激发，而不是通过光子的吸收。化学发光以例如轻棒中的技术应用。众所周知的化学发光物质是鲁米诺，其用于犯罪物质以找到血迹。这里的Fe.２＋血红蛋白中存在的离子作为催化剂，使鲁米诺发光。
如果一个生物体会发光生物发光，无论如何产生这种光线。有很多生物产生光，如萤火虫（骆驼耳菌)或萤火虫(Photinus Pyralis.）.在其他几个真菌的一行中非常非凡的生物是杰克奥兰特·蘑菇（omphalotus nidiformis.），在黑暗中发光。许多海洋生物如一些珊瑚，藻类，甲壳类动物或甚至鱿鱼都发光，主要是在蓝色或绿色光谱中。另一个海居民是生物糖粉的水母Aequorea Victoria，来源绿色荧光蛋白（GFP.）.举例来说，萤火虫只使用化学发光的过程来发光，A.维多利亚使用化学发光和荧光过程。由于科学家发现，水母在蛋白质的帮助下通过化学反应产生蓝光aequorin.．然后，这种蓝光被用来刺激前面提到的GFP.在荧光反应中导致绿色发光。
这使我们提出了问题：“荧光是什么？”荧光是一种过程，其中物质发光作为吸收较短波长的光的效果。打电话的波长差异斯托克的转移．详细地，如果物质以光子形式吸收光，则会发生荧光。这导致电子转移到更高的能量水平。但这种高能量的情况是非常不稳定的，这就是为什么电子倾向于返回地面状态。在该过程中，能量再次以可被视为发光的光子形式释放。与磷光相比，电子能量移位非常快，实际上在纳米秒的范围内（图1）。任何能够在与另一个不同波长的激发后发射明显波长的物质的任何物质被称为a荧光染料．这些是在下一节中讨论的。大多数本质上发生的荧光物质具有广泛的激发和发射光谱，但具有明确定义的激发和发射最大值的物质对荧光显微镜更有用。
类似于荧光，磷光是一种发光现象，其中磷光材料被光激发。尽管它与荧光密切相关，但速度要慢得多。与荧光相比，光子的再发射由于激发态电子能量与“禁”态的关联而减慢。它们返回基态的速度不像荧光那样快，因为能量被“捕获”了。磷光材料的典型例子是“在黑暗中发光”的玩具，它可以用普通灯泡或日光“充电”，然后发光几分钟甚至几个小时。
荧光料
如上所述，a荧光染料是能够荧光的任何物质。在我们的情况下，荧光蛋白是荧光染料。在详细介绍之前，我们将介绍一些描述荧光蛋白的术语和表达。与荧光有关的通常使用的单词是荧光团：a荧光团是分子（例如蛋白质）的一部分，其负责其荧光的能力。所以GFP.或者它的衍生物是任何杂交蛋白质连接的荧光团GFP.或其衍生物(如α-微管蛋白-GFP.）.但荧光团不一定是蛋白质。小分子如FITC，Tritc（20原子）或量子点（100-100,000原子）等也是荧光团。
更深入地观察荧光团我们到达发色团在发色团内部，电子的能级转换和相互关联的光发射(见上图)发生。至少有两种形式的发色团。它们要么是由共轭π-电子共振系统(GFP.）或金属配合物（叶绿素，血红素）。
由于其对显微镜的相关性，我们将仔细看看发色团GFP.．事实证明，为形成的形成GFP.除氧分子外，没有其他辅助因子或酶组分是必需的。的主结构定义的GFP.氨基酸骨架，它在自催化的折叠机构中自发地形成，通过分子内重排完成。详细说明，发色团是由三种相关氨基酸制成的。Ser65，Tyr66.和Gly67依次进行环化、脱水和氧化。这些反应的结果是共轭π-电子谐振系统，成熟GFP.发色团。
看整个GFP.结构上，环状三肽位于圆柱体的中间。这个圆柱体是由11股构成的β-桶结构，使蛋白质具有很高的稳定性。β-桶结构的直径约为3nm，高度约为4nm (s.图3)。目前已知的所有FPs都有这种保护柱，这对它们的光物理性质有很大的影响。在……的情况下GFP.，量子产率和光稳定性相对较高。此外，非常紧凑的蛋白质结构导致高pH抗性。标本与A.GFP.-TAG对温度相对较强，对如多甲甲醛，尿素或盐酸胍如多甲醛，尿素或胍丙啶等变性物质表达了高耐受性。
淬火和漂白
尽管如此，对于下一节中应提及的FPS存在某些限制和限制。这个过程淬火，例如，以可逆的方式降低荧光团的强度。造成这种衰退的原因有很多。一方面，可能有一个复杂的形成或内部转换。另一方面，淬火可以是能量传递过程的影响。一个微观应用程序叫做烦恼利用此程序。在Förster-共振 - 能量 - 转移或荧光 - 共振 - 能量 - 转移供体荧光团D的能量转移到受体荧光团A中。D的荧光降低，而荧光增加。
与淬火是可逆过程的淬火，存在不可逆的荧光减少过程漂．永久荧光损失是基于长时间暴露在激发光下荧光团的破坏。漂白的量取决于强度，曝光时间和光源的能量。每个荧光团在漂白之前都有一定的激发和发射周期。在……的情况下GFP.每个分子可以被激活约10个4-105次了。这符合0.1-1 s。
使用共聚焦激光扫描显微镜光强度约为106W / M.2是常见的。这种高能量剂量可使光子过量导致许多荧光分子在其激发状态的现象。在这种情况下，它们不再在其通常的波长下吸收光。通过，有效的染料浓度减小或换句话说，在监视器上描绘的像素不再是染料浓度的直接函数。与用简单的弧灯的照明相比，使用高能激光可以导致发射和激发之间的非线性关系。
量子产率
说到荧光蛋白的效率，我们应该提到量子产量．这是荧光团的另一个特征，比较光子输入和输出。对于一定荧光团的量子产率计算，发射的光子被吸收的光子除以所吸收的光子：
因此，对于100％的产量，量子产量将是1.用于激发的每个光子会在发射中产生一个光子。但是，这只是理论价值。在实践中，必须花更多的光子来激发比你进入发射的光。量子产量GFP.例如，0.6（见表1）.换句话说，在发射中获得6个光子，必须使用10个激励。
亮度
的亮度在施加荧光显微镜时，荧光蛋白是考虑的另一个重要特征。根据显微镜的质量，该参数是实验成功的关键点。指定荧光蛋白亮度的客观方式是其摩尔消光系数的倍增，其量子产量除以1,000。物质的摩尔消光系数告诉我们一些关于其在不同波长的光的吸收。详细地，摩尔消光系数是通过在不同波长的距离1cm的距离在1cm的距离上通过摩尔浓度的物质吸光电磁辐射的尺寸。因此相应的单位是m1厘米1．
借助该计算，可以比较不同荧光蛋白的亮度。如果我们采用摩尔消光系数为56,000米的EGFP的示例1厘米1和量子产率为0.6，我们得到33.6米的值1厘米1．有时人们会谈论荧光蛋白的相对亮度。在这种情况下，亮度的计算方法是将摩尔消光系数与量子产量相乘，再除以EGFP的亮度值(33.6 M)1厘米1）.通过这样做，相对亮度转换为众所周知的EGFP，使不同荧光蛋白的比较稍微快一些。
耐光性
很多荧光显微镜实验都处理了活细胞的观察。采取特点，如淬火和漂白考虑，显然，生命细胞成像高度依赖于时间。即使在组织学或固定电池样本的情况下，也很重要，而不是照射你的标本过长的时间和太多的光强度。描述利益荧光蛋白抗蚀机制降解其荧光行为的能力的参数是光稳定性。耐光性表示为通过的秒数，直到50％的初始亮度消失。为了比较，照明由弧灯提供，最大为10W / cm2，虽然高强度光源如激光器（高达100W / cm2)可能产生非线性效应。此外，为了测量和比较光稳定性，荧光蛋白样品的pH值被标准化为7.0，蛋白质溶液的液滴适合典型哺乳动物细胞的大小。与上述光源相邻照度为连续照度。同时计算光子的发射。在EGFP的情况下，原始亮度的一半需要174秒才能消失(Shaner等人。2005年）.换句话说，从1000个光子/秒减少到500个光子/秒需要174秒。
知道不同的特征，如激发和发射最大值，一定荧光染料或蛋白质的亮度，量子产量等，实验者能够选择不同的候选或观察条件，以满足他对某些实验设置的要求。此外，如果他知道不同荧光染料或蛋白质的照片物理特征，他能够以详细的方式解释结果。
阅读更多关于荧光蛋白，他们的光谱学特性和他们的应用
参考文献
选择荧光蛋白的指南。Nat Methods 2:12(2005) 905-9。
标题照片：©By DavidMülheims，德国
