荧光蛋白-介绍和光光谱特性

荧光蛋白的A.维多利亚

光谱的特性GFP.或者它的变体是在氨基酸结构中形成的发色团（图1）。这可以是在位置65-67或残基三个氨基酸接近该位置（例如YFP）。除了关于发色团的主要突变，研究还对其他位点定向诱变进行，以改善其它因素，如蛋白质成熟和表达在异种细胞系统（如密码子使用，在生理温度下的蛋白质折叠）。注意A.维多利亚是一种相对原始的海洋生物，没有体温系统。

即使GFP.是最受欢迎的FPs之一，因为它的亮度和高光稳定性，它有两个主要缺点。它们对pH值有一定的敏感性，并有轻微二聚的倾向。二元化或者寡聚化是许多FPS的问题。他们偏好彼此凝集可以产生关于融合蛋白的位置和功能的伪影或误解。但科学家也提出了一些问题的答案。临界位置（F223R，L221K和A206K）处的突变，其中通过亲水性替代非极性氨基酸的突变显示出降低二聚化。导致频谱的改善以及实际特征的所有遗传变化总结在“增强”FPS的名称下。

在WTGFP的情况下，增强功能导致EGFP（增强GFP.）与在488nm处，而不是在395 nm和475nm处先前的复合吸收光谱的单个激发峰。wtGFP（该突变S65T）的第一个突变形式由Roger钱学森等人开发。的5倍亮度比原来的，并呈现出更短的成熟时间。在37℃，更好的成熟效率的基础上，另一种突变（F64L）在一起，这个效力于人在看活细胞中起重要作用。

一个非常有趣的GFP.Stokes位移最大的变体之一是蓝宝石．靠近发色团（T203I）的位置处的突变导致激发最大的激发至399nm，发射最大至511nm。这是一个112 nm的Stokes偏移。翠是另一个GFP.修改与在哺乳动物细胞中改进的光稳定性和亮度和更有效的折叠。

而所有的绿色荧光蛋白都具有相对较高的亮度，蓝色荧光蛋白在微观应用中通常会受到发光强度降低的影响。然而，由于其他光谱特性，它们被用于光学分析。EBFP.（增强型蓝色荧光蛋白）是由几个回合变异wtGFP的构建。第一个（Y66H）跳过来自绿色发光峰的蓝色光谱。多个突变，接着，产生的蛋白质与最大激发在380nm和波长448nm的发射最大值。这些光谱特性使其成为EGFP的合作伙伴烦恼显微镜。最近的蓝色荧光蛋白具有更高的量子产率和更好的耐光性是亚苏貂，SBFP2和EBFP2．一个很有前途的EBFP继承者是一种命名为小天狼星由于其非常高的耐受性的pH值（稳定在pH 3-9）及其作为荧光蛋白具有最短波长的发射迄今为止声誉这成为流行。

第二个“蓝”类GFP.变体是由青色荧光蛋白形成的：CFPS.．的取代酪氨酸色氨酸（Y66W）和进一步遗传改变导致具有改进的亮度和光荧光染料。此ECFP具有445分之433nm和503分之475纳米双峰激发和发射光谱。光辉度，EGFP的只有40％左右。一个突出的ECFP变种天蓝色的，具有较高的消光系数和量子产量。比ECF更亮，用作一个1.5倍。烦恼与yfp合作。

一个GFP.突变不直接改变在发色团的三个中心氨基酸之一导致黄色荧光蛋白上升。yfps.在位203处具有常见的苏氨酸，其由酪氨酸（T203Y）交换。该氨基酸是β-筒的一部分，并且位于发色团附近。相比GFP.，激发和发射特性转移到更长的波长，激发和发射最大值在514 nm和527 nm (EYFP)。EYFP的一个特点是它对pH值的敏感性。在pH值6.5时，EYFP只有大约50%的荧光，这并不总是一个缺点。在pH测量(如囊泡、核内体等)时，EYFP可作为指示剂。有趣的是，进一步的突变(Q69M)产生了更好的酸稳定性，并显著提高了亮度(比EGFP亮75%)。这种蛋白质被称为EGFP，与EGFP相比，它的光稳定性仍然很差茶晶．另一个YFP突变体(F46L)的成熟速度明显加快，抗pH值也有所提高。这种蛋白质被命名为金星而且经常烦恼受体与天蓝色。

在Anthozoa中发现的第一个和仍然是最常用的FPS是DSRED.．海葵的名字来源于海葵心脏病马斯塔．DSRED在558nm处具有励磁最大值，并且在583nm处发射峰值。但是，第一次兴奋在结构信息发表时停滞不前。DSRED比水母FPS慢慢地慢慢地成熟，具有中间发色团。该阶段发出绿色频谱的光，并导致与其他FP重叠。如已经提到的那样GFP.部分，DsRed也有另一个问题。红色荧光海葵蛋白是一种专性四聚体，易于形成低聚体。这可能导致对融合蛋白的位置和功能的误解。一般来说，Anthozoa FPs的结构与Aequorea FPs相似。发色团隐藏在4 nm × 3 nm(高×直径)的β-桶状结构中。不同之处在于anthophya β-barrel的外观更椭圆形(图2)。

在平行于GFP.“进化”，开始修改原来的研究者DSRED克服其结构性缺陷。第二红色荧光蛋白产生 -DSRED2.- 具有降低的低聚物形成趋势和更快的成熟速度，最小化绿色发光中间阶段。进一步的诱变导致红色FP，其完全失去了四聚体状态，而且还被保留了一些量子产率（25％的DSRED2）。Tsien等人的这项工作。是第一个单体红荧光蛋白，因此称为mRFP1．

这mRFP1当时用于创建一组六个单体FP的起点统称“mFruit”．它们的名字来源于它们散发的颜色:mHoneydew、mBanana、mOrange、mTangerine、mStrawberry和mCherry。麦克里最有用的是这些FPS，在610nm的范围内发光，亮度为EGFP的亮度为50％。

最亮的FP迄今已是mFruit派的追随者，并命名为TDTOMATO.．就基因改变而言，dTomato是专性二聚体。但通过将两个二聚反应伙伴放在一个分子中，可以避免二聚反应。两个dTomato单元由一个12氨基酸连接体偶联，形成串联二聚体FP tdTomato，其最大发射波长为581 nm，最高区域具有光稳定性。

当另一个mFruit继承者被创建时，发射光谱进一步移到远红光区域(630 nm - 700 nm)。mplum.是mFruit构件与在649纳米的任何mFruit蛋白的最深红色发光。

科学用过的绿色荧光的半蛋白蛋白质非常小，鉴于众所周知和用户友好的可用性，这不是很奇怪A.维多利亚GFP.．很明显，人们没有看到建立新的绿色荧光蛋白的必要性。尽管如此，有一些，就像从石珊瑚的明亮荧光蛋白Galaxeidae，Azami绿色．与EGFP的序列同源性有趣地小于6％。

一个对深组织成像产生高影响的Anthozoan FP是Katushka．在rfp上应用突变技术大肠quadricolor， Katushka被鉴定为二聚体蛋白，在635 nm处发光最大，在所有深红色荧光蛋白中亮度最高。卡图什卡的单体形式被称为m并在后面提供更高的亮度，导致mKate2．

总之，所有这些目前用于微观应用荧光蛋白从原始海洋生物的。表1包括最重要的与像最大激发和发射，光稳定性，量子产率和亮度及其相关光谱特性在一起。