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光漂白(FRAP)和后代后荧光回收

Frap.(光漂白后的荧光恢复)用于表征细胞分子的迁移率。实验装置包括显微镜,光源和荧光探针,耦合到感兴趣的分子。获取使用低光线水平的几个图像以确定初始荧光,然后在感兴趣区域内的短时间内的高水平被施加以漂白荧光。最后,获取使用灯光水平足够低以防止进一步漂白的另一组图像以通过恢复荧光来获得分子的再分分配。

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照片漂白后荧光回收(FRAP)

Frap.首先用于分析细胞膜内各种脂质分子的迁移率。Frap.也可用于研究膜外的蛋白质动力学:可以监测细胞质内的细胞质内或细胞结构内的感兴趣区域。

光漂白实验可以用共聚焦激光扫描显微镜进行,其中激光器以高强度用于漂白和低强度的图像记录。它在用短的激光用短的激光用短的激光照射荧光团,以擦除荧光,然后进行样本的时间分辨图像记录。因此,存在三种不同的图像序列:具有低激光功率设置的预熔断序列以具有参考值,具有高激光功率的漂白序列,并具有低激光功率设定以检查荧光的恢复。所有其他漂白方法源自该基本原理(图1)。

通常,感兴趣的蛋白质通过表达作为a使荧光制成GFP.(从水母A.维多利亚克隆的绿色荧光蛋白)融合蛋白或通过将感兴趣的蛋白质标记与反应性配体,然后结合荧光染料。在活细胞中荧光蛋白质的最常见方法是GFP.技术。不同的光谱GFP.突变体EGFP是最好的,因为其高量子产率,其光漂白的低趋势以及其在漂白后图像采集期间的相对光稳定性。再分配的速度取决于环境的分子尺寸或粘度或与其他分子或细胞内传输过程的相互作用程度。另外,可以确定移动和固定分子之间的比率。

根据应用的实验有许多可能性,由于实验类型没有一般性配方。请参阅参考文献中引用的文献。

图1:顶部:时间序列中漂白投反投注的荧光强度,漂白间隔标记为红色。底部:时间序列内的示意图中的相同单元。在时间点,漂白细胞内的感兴趣区域(ROI)(箭头)。未漂白的分子正在进入ROI。可以确定再分配的速度。

照片漂白剂荧光损失(翻转)

通常,翻转用于检查像ER或GOLGI装置等蜂窝细胞器是否互连。翻转实验可以深入了解分子是否是移动,固定或限制在隔间。

图。图2示出了在时间序列内的示意图中的相同细胞。从时间点开始,重复漂白细胞内的感兴趣区域(ROI)(箭头)。漂白的分子正在散布。荧光的损失表明,细胞器是否物理连接。

反逆流

与此相反Frap.,逆Frap.(一世-Frap.)允许直接分析荧光分子。细胞器外的荧光分子被漂白。因此,可以直接监测细胞器中的荧光分子的流出而不漂白它们。缺点是该方法需要大量的光强度来漂白整个细胞。

图。图3示出了在时间序列内的示意图中的相同单元。在时间点,整个细胞区域被漂白(箭头)。不漂白的分子正在散布。可以测量细胞中荧光恢复的速度。

光漂白后荧光定位

光漂白(翼片)后的荧光定位是一种可以应用于两个通道的比例方法。实验需要两种不同的荧光标记,并且只漂白两个标签中的一个。两个标签可以标记为两种蛋白质或一个。非漂白种群是参考措施。然后,漂白和第二非漂白区域的比例然后介绍蛋白质的迁移率。与此相反Frap.并翻转,它是一种直接测量方法,可以应用于改变它们的形态相当快的结构。

图4:在时间序列内示出了示意图中的相同细胞。在时间点2中,ROI被漂白(箭头),其具有合适的波长,例如,仅漂白红色荧光。

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