定量荧光

在化学和物理学中众所周知的方法是松弛方法[1]．被测量的信号-在我们的例子中荧光强度-在平衡中是恒定的。在扰动之后——作为一个脉冲或参数的跳跃发生，强度将改变并达到一个新的平衡。变化的动力学反映了控制竞争路径的机制的细节。该方案提供了一种优雅的方法来测量荧光标记分子的迁移率。如果施加强光(脉冲扰动)使部分场褪色，荧光就会减弱。如果分子不移动，漂白区域将保持黑色。如果荧光分子可以通过扩散或活性过程移动，漂白区域将再次恢复荧光。因此，该方案称为光漂白后的荧光恢复(Frap.）。通过拟合模型曲线向信号的松弛部分揭示潜在的机制。并且不移动（固定级分）的分子的分数衍生自平衡信号水平的比率[^{typo3 /}2]．

Frap.通常用于测量细胞中的扩散过程。除了经典的Frap.，有时使用衍生物:FLAP，这是一种光漂白后的荧光损失。在这里，漂白持续发生在一个区域，与漂白区域没有交集。iFRAP是指除一小块区域外整个区域都漂白的方法。更多的首字母缩略词用于漂白方法，但这些都没有实际意义。

技术上类似，但基于完全不同的机制，是荧光蛋白的激活实验。这些蛋白质是荧光的，可以被打开或关闭[3.通过不同的照明颜色。或者，荧光发射光谱发生变化[4开关灯亮。其优点是可以在黑色或不同颜色的背景下检测荧光，并跟踪分子在细胞或组织中的扩散或主动运输(荧光蛋白激活FPA)。

这些方法不仅适用于移动性测量，而且还适用于浓度变化的动力学测量。众所周知的是离子指示器，例如离子指示器。用于钙。模型生物传感器，通常基于烦恼-这部电影，可以监测多种细胞参数，包括代谢物浓度和膜电位。

当光子从荧光分子中发射出来时，其波长stokes-位移到红色，即能量小于激发。如果第二个荧光分子(受体a)的激发能在第一个分子(供体D)的发射范围内紧密接触，能量转移的概率随着6的增加而增加188金宝搏的网址^th无辐射吸收距离的功率(无辐射)。这个现象是由Theodor Förster首先分析和正确描述的，因此称为Förster共振能量转移(烦恼) ［5]．

直接应用烦恼是受体仅在供体照射下发射的荧光的分析(敏化发射SE)。或者,烦恼还通过漂白受体并测量漂白前后的供体荧光来测量效率。如果烦恼发生了，施主将在受体漂白后更明亮地闪耀，因为没有能量流向受体，因此所有能量都被转化为供体排放（受体漂白AB）[6typo3 /]．这类实验是通过蛋白质之间的相对距离来证明蛋白质之间的相互作用。

的烦恼这种现象也被用于现代生物传感器中。这些(通常是复杂的)分子包含一个供体和一个受体。一旦与目标结合或感应到目标，分子就会发生构象变化，改变D和a部分的相对位置，从而改变烦恼效率。由于1/r，这些传感器非常敏感⁶依赖Förster-Wechselwirkung。

在适当的能量（颜色）的光子激发后，分子或原子的电子系统将呈现激发状态。从该状态下，通过发射荧光光子，系统将放松到地状态。显然，系统必须在激发状态下留一段时间。这次被称为荧光寿命。在分离的分子中，平均寿命由量子物理学统治，因此是分子的特性。实际寿命统计地分布在平均寿命周围。典型的平均寿命跨越0.5至10纳秒。

在现实中，荧光分子与微环境中的其他分子相互作用，并与辐射相互作用。这些参数可以使激发态放松得更快。7typo3 /]．一个众所周知的现象是荧光猝灭与其他分子的动态相互作用。在这里，能量以热量的形式散失。第二个途径是上文所述的Förster -Wechselwirkung。如果荧光分子(供体)与受体相互作用，平均荧光寿命就会降低烦恼过程是荧光发射途径的另一个竞争途径。由此可见荧光寿命的变化烦恼发生 - 这是测量的参数这部电影-烦恼生物传感器实验[8typo3 /]．最后，激发态可能与光子相互作用，导致进一步转换到其他态，或通过发射额外的光子返回基态(受激发射[9typo3 /])。

测量荧光色素的实际平均寿命是通过脉冲激励和随后的衰减发射测量或通过调制激励和发射的相位和振幅调制测量来完成的。最精确和通用的测量是时间相关单光子计数(TCSPC)，它采用测量从激发到发射的第一个光子的时间延迟。结果是一个分布曲线(通常是指数衰减)，它允许通过曲线拟合提取寿命。该方法应用于图像的所有像素，最终生成荧光寿命图像(也称为“tau-map”)。这些图像中的值不是灰度，而是时间。

除了传感环境的优势，这部电影与染料浓度和吸收伪影无关，例如在样品的较深层。

共聚焦显微镜观察从衍射受限的微小光点发出的光。测量是光强度作为时间的函数。通过扫描样本上的点并将信号分割成短片段，这些比特可以被分配到帧存储中并作为像素存储。如果触发正确，帧存储包含强度分布作为空间(图像)的二维函数。

另一方面，也可以仅分析信号及其变化 - 有或不在样品上移动斑点。这种方法允许各种测量。首先，由于漂白现象，平均强度通常会降低。此外，通过在不同级别之间切换照明来测量三态状态动力学。最常见的不是平均信号，而是分析信号的变型（波动）。如果在观察到的样品中，则许多分子，与信号相关的波动将非常小，因此不可估量。微小的共聚焦聚焦具有仅含有少数分子的有益特征（取决于光学参数和染料浓度，当然）。分子的数量足够小，以检测由于分子闪烁（分子假设暗状态并返回到可激情状态）而发生的变化，以及由于焦卷体内的扩散（或任何其他运输机制）引起的数量的改变［10]．

通过相关方法分析变化允许测量染料浓度(样品中的局部变化)和传输动力学。通过拟合模型系统到测量的相关函数，潜在的分子运输机制的分类是可能的。定性测量也是可能的，例如不同隔间的扩散系数。

已经开发了各种衍生方法以分离特定的相关性（FCCS.)或提高结果的可靠性和精确度(方法［11])。