2011年12月14日辅导的

FLCS–荧光相关光谱的进展

在单分子水平上对物质进行表征已经成为科研机构标准剧目的一部分。最常用的方法之一是荧光相关光谱法(未来作战系统)，可用于检测荧光分子在溶液中的动力学和浓度。本文描述了一种结合了经典的测量技术未来作战系统采用时间相关单光子计数测量，获得更精确可靠的结果。

作者

^1.PicoQuant GmbH，柏林，德国

主题和标签

介绍

未来作战系统通常用于研究溶液中分子的动力学过程。然而，实验因素会严重影响这种分析未来作战系统数据记录。典型因素包括测量系统的伪影、杂散光、荧光团的三重态、杂质或样品的背景。由于这些因素不是恒定的，而是在不同的样品之间存在着很大的差异，因此，对不同样品进行分析是可行的未来作战系统实验经常会出现问题，并且容易出错。因此，在执行特定的数据分析之前，最好根据物理定律清理数据记录。

遵循明确数学分布概率的一个物理值是荧光衰减。荧光寿命相关光谱法(方法)这里描述的是使用荧光衰减行为来清洁未来作战系统数据集。方法例如，可以用来消除测量系统的伪影，或从几个荧光团的混合物中分离数据记录，然后分别对每个荧光团进行分析。这种类型的评价产生明确和可重复的结果，即使是最小的荧光团浓度。

单分子光谱

荧光相关光谱学原理介绍于七十年代[1 - 3描述了在椭圆体积溶液中荧光单分子的研究。结合共聚焦显微镜[4.]，未来作战系统已成为研究分子动力学和浓度的一种重要的测量方法。

在一个未来作战系统实验中，典型的连续激发光聚焦在组织或溶液中的一点上。通过使用共聚焦装置，可以观察到体积约为0.3飞升的分子(图1A)。这个体积由激发和发射波长、物镜和共焦针孔的大小决定。

这个实验本质上是基于布朗运动的:分子扩散通过探测体，被激发并发光。测量的对象是由此产生的荧光强度的时间变化(图1B)，但它也可能受到其他光物理过程的影响。

分析的第一步未来作战系统数据是根据测量的荧光强度计算自相关。然后，对获得的自相关函数（ACF）拟合具有可变参数的合适模型函数，从该函数可以导出荧光团浓度或扩散常数。分析ACF时面临的挑战是找到一个合适的模型函数，该函数具有可变参数，不仅能描述荧光团的实际性质，还能描述影响实验的因素。由于每个附加影响都需要至少一个附加参数，因此分析的复杂性和包含错误的趋势增加。如果样品也有一个以上的荧光团，每个荧光团的扩散行为会影响产生的ACF，这不是简单的线性组合，而是单个信号的复杂叠加。

图1:一个未来作战系统实验。（A）在共焦装置中聚焦激光束产生的测量体积（深蓝色）。（B）记录样品时荧光强度的波动未来作战系统自相关函数的数据记录和计算。

不同的方法

多年来，各种版本的未来作战系统已建立以处理与ACF分析相关的问题。所有这些方法的目的是清除背景伪影的数据，并允许同时研究几种荧光分子。

最常用的方法是荧光相互关光谱法(fcc)，其中荧光由两个探测器同时记录[11]例如，探测器后脉冲是最常见的实验伪影之一，可通过以下方法消除：fcc．这是在测量过程中由探测器反馈引起的幻像脉冲。通过将发射的光子按等份分布到两个探测器上，然后从两个数据记录中计算相互关系，可以消除干扰信号。

fcc还允许分离具有不同光谱发射波长的荧光团，从而进行单独的数据分析，以确定扩散常数和浓度。此外，两个信号的相互关联提供了有关所研究分子潜在相互作用的信息。然而，t不应低估实验装置。单独检测荧光团的检测体积必须重叠100%，这并非小事，因为检测体积大小取决于激发和发射波长。此外，荧光的绝对光谱分离通常无法实现，这反过来，数据记录分析变得更加困难。

其他方法从数学上分离数据，例如基于扩散常数的不同。然而，分子的扩散常数必须至少相差1.6倍[5.]以获得有用的结果。因此，该测量方法不允许简单读取分子浓度或扩散常数，而是基于ACF的高度复杂的数学拟合，包括通常无法通过实验证明的假设，因此极易出错。

时间相关单光子测量的改进

利用荧光寿命相关光谱法可以解决上述问题。在一个方法实验中，不仅测量了荧光强度的时间变化，而且还测量了脉冲激发后荧光团的特定荧光衰减行为，并用于清洗未来作战系统数据记录。而不是对测量数据的分析做出假设，方法是基于一种纯粹的数学评价方法。

大体上方法是由未来作战系统和时间相关单光子计数(TCSPC)，是最适合测量单个分子荧光衰减行为的方法。TCSPC需要脉冲激发激光器和单光子敏感探测器。

实验原理

为方法实验中，TCSPC测量是在一种特殊的“时间标记时间分辨”（TTTR）测量模式下进行的。这里，为每个检测到的光子测量两个相互独立的时间：第一，激发脉冲开始和探测器信号到达之间的时间（微观到达时间）使用皮秒分辨率，其次是从实验开始到特定光子注册的时间（宏观到达时间）。

微观到达时间用于生成描述特定荧光衰减行为的TCSPC直方图。宏观到达时间可以像在任何经典中一样使用未来作战系统计算荧光强度随时间的变化，并通过计算ACF确定扩散常数和浓度的实验。

对于一个未来作战系统在荧光团混合物受到连续激发的实验中，检测到的每个单光子都有一定的概率是由荧光团a或荧光团B发射的。这种概率在时间上是恒定的，因为没有确定的激发时刻。方法基于脉冲激发产生特定激发时间这一简单事实，这意味着荧光团a或荧光团B发射的光子的检测概率随时间变化（图2A）。激发后不久检测到的光子更有可能由衰减较快的荧光团（寿命较短）发射，而晚期光子更有可能由衰减较慢的荧光团（寿命较长）发射。基于与时间相关的检测概率，可以应用数学方法建立统计概率滤波器，为每个光子到达时间分配起源概率[10)(图2 b)。

图2:(A)两个荧光团A(红色)和B(蓝色)以及混合物(黑色)的荧光衰减行为。(B)统计滤波函数，为每个光子到达时间分配一个概率，光子从荧光团a(红色)或B(蓝色)发射。

为了建立合适的分布滤波器，除了需要测量本身的TCSPC直方图外，还需要各组成成分的直方图。例如，如果想要分离荧光团，则需要纯荧光团的TCSPC直方图。为了从测量中去除杂散光成分，必须进行不含荧光团的额外测量。然后分布滤波器给每个光子到达时间分配光子从特定分量产生的概率。因此，这种数据分离在单光子水平上发生。然后可以通过计算ACF来独立地分析分离的数据记录。

这种类型的统计分析不仅适用于检测荧光团的发射，而且同样适用于描述测量系统的伪影，如探测器的暗计数率和后脉冲(图3A)。关于这一主题的文献已经包含了成功地将测量数据记录分解为多达4个子组件的例子[7.]．

总的来说，重要的是要注意方法使用整个荧光衰减行为进行分离，而不是可以从中确定的平均荧光寿命。如果在TCSPC直方图中显示不同的轮廓，荧光团或组分可以从数学上彼此分离。

示例应用程序

该系统的功能性、有效性和稳定性方法该方法已在极其广泛的应用中得到证明，不仅体外但也在活的有机体内. 即使是简单的未来作战系统实验分析只有极低浓度的荧光染料，使用方法使分子浓度和扩散速度的测量具有更高的精度和再现性。图3显示了一个示例方法测定溶解在乙二醇中的染料Atto655。由于低摩尔溶液中的杂散光成分较大，只有约60%的检测到的光子来自染料，这对确定的荧光团浓度有负面影响。对比使用和不使用寿命滤波数据分析的自相关曲线(图3C)可以看到，通过消除包含杂散光和系统伪影的测量背景(图3A)和3 b,红线)，检测到的分子数量要少得多，这构成了溶液的固定分子浓度(10 pM)的一个很好的近似。该方法也得到了成功的应用在活的有机体内单元测量，其中方法用于从数据记录中删除细胞中存在的类黄素和NADH分子[8.]．

巴黎大学狄德罗分校的Mai't'Coppy MiSein实验室最近能够证明，也有可能消除绿色荧光蛋白在mCherry检测通道与荧光蛋白绿色荧光蛋白和樱桃在一个在活的有机体内fcc实验[9]．在这里,绿色荧光蛋白用脉冲激光激发，用连续波激光激发。这使得无需对ACF进行数学拟合即可进行蛋白质相互作用研究。