通过测量荧光团发射位移来估计离子浓度和pH值或电压变化
研究活动越来越集中于识别和时空分布，例如细胞或细胞网络中离子浓度、电压或pH动态变化的局部“热点”。这些“热点”通常位于细胞的特定部分或细胞网络中的某些细胞中。此外，在细胞代谢或结构方面，这些区域通常与标本的其他部分有不同的特性。用于研究动态生理状态的传统荧光团会随着离子结合、pH值变化或电压变化而改变其发射强度(例如，氟-4在钙结合时发射强度增加)。然而,这些标记不考虑结构的差异,直径或标记吸收/表达式可能会改变反射光的数量不与实际的离子浓度相关性,电压或博士定量和同等检测细胞结构的变化或不同的细胞,需要一种对结构直径和荧光团浓度不敏感的方法。与非比率成像方法相比，比率成像提供了机会，可重复测量细胞内绝对离子、电压和pH水平/随细胞直径、荧光体浓度和成像装置的光学特性的变化。然而，比值成像依赖于激发波长或被测波长的快速变化、强光源、光学元件优异的透射性和快速的信号检测。超快过滤轮的最新发展，紫外线-光优化目标，高灵敏度荧光团和新的CCD相机允许负担得起的高空间分辨率定量高速活细胞成像。
双波长激发/检测是测量荧光团发射位移的关键
如上所述，在比率成像中，成像的是发射位移而不仅仅是强度变化。为了测量发射位移，必须通过使用两个不同的激发波长或在两个不同的发射波长检测来测量一个荧光团或荧光团组合的强度变化。对于常用的钙成像染料fura-2，染料必须用波长为340 nm和380 nm的光激发，检测波长为510 nm。与此相反，钙成像染料indo-1通常在350 nm波长下激发，检测波长分别为405 nm和485 nm(参见比例成像的典型应用图1)。
图1:使用比例钙指示剂呋喃-2的钙成像实验的延时快照。图示为340 nm(左)和380 nm(中)激发后的伪彩色图像和相应的计算比率图像(右)。图像序列显示了三个时间点:在第一个时间点(1)细胞没有受到刺激，细胞内钙处于静息水平。在第二个时间点(2)，细胞受到刺激，钙离子处于最高水平。在第三个时间点(3)细胞内钙水平下降。图中标明了相应的时间点。上图为340 nm图像的强度，中间为380 nm图像的强度，下图为比值强度。
但为什么需要双重激发或发射检测?为什么不简单地测量荧光团强度的变化呢?
在一个实验中，荧光团被用来检测离子水平、电压或pH值的变化，发出的荧光强度取决于几个性质。下面的公式说明了这些问题:
F =荧光强度;C =荧光团浓度;D =试件直径(z轴);K =光通路中各组分的光学常数(细胞特性、物镜、滤光片等);f(x)描述了当离子被束缚或电压/pH值发生变化时，给定荧光团的发射行为。
方程表明，光强很大程度上取决于光程中荧光团的数量。光路中荧光团的数量取决于细胞中荧光团的实际浓度(c)(由标记物摄取或表达决定)和成像标本的直径(d)。这使得仅通过观察荧光强度就很难直接估计所研究离子的浓度、pH水平或电压变化，例如，我们不能说:“细胞中游离钙的强度为100 = 100 nM”。样品直径(d)、荧光团浓度(c)和样品和装置的光学特性(K)很难测量，但对检测的总体强度有很大影响。此外，必须记住，上面所示的公式对试样中的任何给定点都是正确的。由于直径(d)和荧光团浓度(c)在整个样品甚至在单个细胞内都不均匀，因此在采集的样品图像中，每个像素的c和d值可能不同。例如，在样本的“A”点，细胞的直径相当高，而游离钙相当低，那么光强度可能与“B”点相同，而B点正好相反。然而，由于检测到的荧光强度相似，实验者可能会错误地得出结论，认为两个地方的钙浓度相似。
图2:上图旨在说明可能发生的误解，例如，如果细胞内的钙浓度是由非比例钙敏感荧光团发出的光的强度来判断的。下面的曲线表示细胞不同部分感兴趣区域(ROI)的光强度。
在上图(A)中，细胞在不同的隔间中有不同的厚度(d在公式中)，比如细胞突起通常是精细的结构(如神经元的树突和轴突)。由于光路内的所有荧光体都被激发光激发，它们发出的光被收集起来，细胞较厚的部分看起来比薄的部分更亮。这可能导致一种假设，即细胞较厚部分的钙浓度高于相对较薄的部分，尽管实际的钙浓度是相同的。
在下面的草图(B)中说明了一种不同的情况。在某些细胞类型中，荧光团的摄取可能因细胞间隔而异。在下面的示意图中，细胞较厚部分的钙离子浓度(公式中的c)较高，但这个区域的荧光团浓度较低。由于钙敏染料检测到的荧光强度不仅与细胞内的钙浓度有关，还与荧光团浓度有关，因此可能会产生整个细胞内的钙浓度是相同的印象。
为了克服这些问题和精确测量绝对离子浓度，pH水平或电压，比率成像已经发展。所有的比率方法都有一个共同点，即发射光的强度被测量两次，然后计算这些强度的比率(R)。取决于所使用的荧光团或荧光团的组合,两个不同的荧光团要么是兴奋与光波长和发射强度测量波长,荧光团或荧光团组合是兴奋与光的波长和发射两种不同波长的测量。这简单地说，就是获取两个灰度图像，并从它们计算一个比率图像。两幅灰度图像的强度通常是不同的，但图像中每个像素的强度可以用如下公式描述:
F =荧光强度;C =荧光团浓度;D =试件直径(z轴);K =光通路中各组分的光学常数(细胞特性、物镜、滤光片等);f(x)描述了当离子被束缚或电压/pH值发生变化时，给定荧光团的发射行为。
正如比值成像的名称所暗示的那样，计算同时获取的两个图像的每个像素的比值值。例如，如果使用非常常用的钙敏感染料Fura-2(激发在340和380 nm)，得到的方程为:
根据简单的数学，c d K可以消去，其比值可以描述为:
根据简单的数学，c d K可以消去，其比值可以描述为:
利用两幅灰度值图像计算虚比图像
实际上，这个比率是由计算机计算的，在很多情况下是在延时实验期间在线计算的。通过计算两个独立获取的灰度图像对应像素的灰度值比，生成灰度值比图像。请记住，灰度值图像基本上是一个灰度值矩阵，其大小与相机分辨率或感兴趣区域(ROI)(通常为512x512，最高可达1,000 x 1,000像素)。在荧光染料Fura-2的钙成像延时实验中(激发波长:340 nm和380 nm，发射波长:510 nm)，结果如下(假设图像大小为3 × 3像素):
图3:强度读数值的简化说明CCD在钙成像实验中，使用fura-2钙探针，摄像机可以传送到计算机上。在这种情况下，图像将是3 × 3像素的大小。上面三个矩阵代表钙静息浓度在340 nm和380 nm激发下的强度读数值加上相应的比值值。
较低的三个矩阵表示在高亮像素中钙离子升高时的强度值变化。在340 nm处的值增大，而在380 nm处的值减小。然而，相应的比率值也会增加。
在延时实验中，对每个图像对的每个像素执行此操作，创建一个比率图像堆栈。最后，一个假彩色地图可以应用到比率图像堆栈，然后堆栈可以观看和量化，就像一个正常的灰度值延时电影。
除了上述优点外，比率的计算还有一个额外的优点。当用离子、电压或ph敏感的荧光团进行活细胞成像时，在各自波长处的荧光强度经常发生微小的变化。然而，在比率成像中，在大多数情况下，一个波长的强度增加，另一个波长的强度降低(无论探针是被激发还是被两个波长检测到)。如果随后计算获得的两个图像的比例，基线和信号振幅之间的差值将比仅仅荧光团的强度变化得到增强。因此，比率成像放大了被检测信号的幅度。这是特别有趣的烦恼在能量转移过程中，受体蛋白的荧光强度下降而受体蛋白的荧光强度增加。
阅读更多关于比率成像
比率成像需要一个专门的设置