如何准备免疫荧光显微镜的标本

根据实验类型的不同，IF有两种不同的变体:在直接IF或一效IF中，与荧光色素相连的一效抗体用于与目标结构结合并直接显示。

在第二变体中，称为间接或次要IF，进行两步孵育。首先，特定的一抗识别目标结构。然后施加荧光染料偶联的二抗，其特异性结合初抗体。通过将二次抗体引导升高升高的物种来获得这种特异性（参见抗体和荧光染料)．比较两个如果变体，每个都具有不同的优点和缺点：

通过将一抗与荧光铬偶联，直接IF比间接IF更快，因为省去了耗时的洗涤和孵育步骤。直接IF易于操作，适用于临床等标准化IF实验中样品的快速分析。然而，必须使用一种功能良好且与抗原高度亲和性的一抗。这同时也是一个负面的方面，因为荧光偶联和验证的一抗价格昂贵。此外，每个目标结构都需要单独的一抗，与间接IF相比，直接IF中抗体与荧光色素的连接限制了实验设计的灵活性。

这种灵活性是间接IF的一个重要优势。通常，在一次IF反应中，同一样品中需要看到多个不同的目标结构，因此必须为每个目标分子选择一个离散的荧光色素。在间接IF中，不同的荧光偶联二抗可以与不同的一抗结合(当然考虑到物种的反应性)。相反，如果你想在直接if中“玩”你的目标结构的颜色组合，你需要每个颜色的单独一抗。间接法的另一个优点是通过二抗进行信号放大。多个二抗分子可以结合一个一抗，从而导致一抗的分子量增加荧光，这意味着必须使用较少的初级抗体。

间接IF的工作流程可能需要更多的时间，但由于一抗和二抗可能结合，而且通常更经济的程序，它是大多数研究人员的选择方法。

高质量IF染色最关键的工具是一个好的一抗。与此同时，在几乎每一种细胞类型中，几乎每种蛋白质都有一种甚至是几种商业化购买的抗体。然而，这里有一些非常重要的事情需要注意。

为了根据你的IF染色做出精确的科学或临床声明，你必须确保你的一抗对目标抗原的特异性。在这样做时，您不应该完全依赖您的商业供应商的声明。根据相关文献中已经使用和验证过的一抗选择你的抗体。检查抗体的数据表在制造商的网站上的可用的图片IF染色，并将它们与你的预期或其他出版的插图进行比较。请注意抗体的单克隆性，因为单克隆抗体只与一个表位特异性结合，而多克隆抗体可以识别多个表位，使得非目标结构的非特异性标记更有可能。因此，特异性高、亲和性好的单克隆抗体通常价格较高，但效果也较好。

如果你想进行多色间接If，不同的一抗必须来自不同的物种，以便通过随后标记荧光偶联的二抗来区分免疫复合物(见表1)。例如，你使用来自小鼠的抗体抗蛋白A进行If，兔抗蛋白B抗体和大鼠抗蛋白C抗体。在选择二抗时，你必须记住每一种抗体只识别一种一抗。此外，在本例中，三种二抗的荧光染料必须在波长谱上有所不同，才能在显微分析中区分它们的荧光信号。如今，几乎可以购买到与紫外线到红外线波长范围内的荧光色素相关联的抗一抗的二抗。因此，研究人员只受到可用配置的限制显微镜(滤光片，激发激光器)。

IF协议存在于各种不同的标本或样品。最简单和最常用的方法是对细胞培养的(真核)细胞进行染色。粘附生长的细胞可以播种在盖，多孔插入或直接在玻璃底培养皿上，并在所需的时间用于IF。将细胞应用于载玻片后的悬浮细胞也可以进行IF，例如通过细胞旋光。在这两种情况下，重点都是细胞内过程或结构的分析，这被称为免疫细胞化学(ICC)。

免疫组织化学(包含IHC）打字错误3/另一方面，蛋白质或分子的存在是在组织特定的环境下检查的。这里，器官准备的超薄切片(通常包埋在石蜡中)被用来研究健康器官和病变器官中蛋白质的表达。除了制备组织切片外，还可以对整个生物体进行IF，这一过程被称为“整个安装”包含IHC"．为了这个目的，不同模式生物的胚胎，例如老鼠，鸡或斑马鱼，或植物模式生物拟南芥芥使用。在整个山上包含IHC一种是受样本大小和相关IF试剂穿透深度的限制。单独的培养步骤比培养细胞染色的时间长。此外，还必须配备用于分析大样本的特殊光学设备的显微镜。

在IF过程中应特别注意洗涤步骤，因为适当的洗涤可以提高IF质量。PBS是一种标准的洗涤缓冲液，而像PBS这样的变体⁺⁺PBS-T也很流行。美国公共电视台⁺⁺包含1mm CaCl₂和mgcl._2.这被认为具有防止细胞分离的膜稳定作用。对于PBS-T，添加最终浓度为0.05%的洗涤剂吐温20，以增加抗体的结合特异性。非常重要的是小心地涂抹和抽吸洗涤缓冲液，以免细胞从其培养容器或盖玻片上分离。如果您有足够的时间，在抽吸步骤之间留出几分钟进行清洗，以确保清洗缓冲液有效扩散到样本中。IF程序的各个清洗步骤在下面的标准协议中列出。

常规IF反应的各个步骤描述如下。本文的末尾附有一份用于培养细胞的间接IF最常见程序的标准协议。

固定是中频手术的第一步。其目标是维持细胞、细胞形成或组织处于当前状态，并在较长时间内保存化学试剂的制备。在固定过程中，重要的是细胞结构尽可能保持其固有的构象。IF不同的固定方法是有用的，每种试剂对一抗的表位有不同的影响。抗体结合位点可能被固定所掩盖或损坏，从而影响IF染色的质量。由于每个抗体与其抗原的结合依赖于不同的固定化合物，因此有必要尝试几种固定新抗体的方法。通常，可以在抗体数据表上找到合适的固定剂的规格。理想的固定保存了细胞和亚细胞的结构，并为良好的抗体结合提供了畅通的抗原。事实上，你必须在两者之间找到平衡。

固定试剂可以大致分为两组：化学交联剂和有机溶剂。

化学交联剂，如甲醛，通过其游离氨基交联蛋白质；在大多数情况下，细胞形态保存完好。然而，抗原也是交联的，这可能会减少抗体结合。戊二醛对细胞结构也有防腐作用，但在显微镜下会导致样品的高自发荧光（见控制)．

像甲醇或丙酮这样的有机溶剂具有脱氢作用并沉淀蛋白质，从而将它们固定在细胞环境中。但是要记住，可溶性分子和许多脂质成分在这个过程中会丢失。经常使用甲醇和丙酮的组合，因为尽管甲醇是保存细胞结构的最佳方法，但它对许多表位有极其负面的影响。丙酮在这里危害较小。你还应该考虑荧光蛋白，比如GFP.，它们已经存在于你的细胞中，在有机溶剂的固定下会很大程度上被破坏。如果生产一抗的厂家没有提出固定剂，在室温下用4%甲醛开始固定10分钟适用于各种细胞株和抗原。

表2:固定试剂。

通过渗透作用，抗体可以进入细胞内结构，否则抗体无法通过细胞脂膜。根据固定的类型，需要单独的渗透步骤。当用有机溶剂固定时，细胞膜已经变得可渗透，你可以直接进行堵塞。用化学交联剂固定的电池需要用洗涤剂进行额外的渗透处理。经典的洗涤剂如Triton X-100或NP-40，但皂素，tween 20或洋地黄素也可以使用。同样，根据应用的物质、它的浓度和孵育时间，会得到不同的结果，所以在开始时应该尝试不同的参数。典型的开始是在室温下用0.1% Triton X-100在PBS中渗透15-20分钟。

如果你想通过If分析脂质相关蛋白或膜蛋白，你应该仔细执行渗透步骤(=脂质去除)。皂苷是一个很好的选择，它可以选择性地从质膜中去除胆固醇，使胞内膜基本保持完整。如果在抗体染色前省略了渗透作用(只能通过化学交联剂固定)，可以特别标记细胞外浆膜结合的抗原，以便将它们与细胞内抗原池区分开来。核酸染料，如DAPI或Hoechst(见核心染色和样品安装）是膜可渗透的，不需要透氧。

阻断是最大限度地减少一抗在细胞内的非特异性结合的重要步骤。为此，可以使用牛血清白蛋白(BSA)、奶粉或血清中的蛋白质。重要的是，这些阻断蛋白不是来自一抗产生的物种，否则二抗对一抗的特异性将丧失。如果你使用二抗，例如用山羊生产的抗小鼠第一抗体的抗体，理想的阻断试剂是正常的山羊血清。封闭液的浓度通常为1%(奶粉，BSA)到5%(正常血清)，并在洗涤液中稀释。在室温下培养30-60分钟。

通过固定、渗透和封闭制备样品后，会发生实际的免疫反应。样品现在与特定的一级抗体一起孵育，以标记所需的靶结构。可以同时将多个一级抗体应用于样品。如上所述，多个一级抗体必须来源于如果是间接多色rom不同种类。抗体稀释最初根据制造商在您选择的封闭溶液中进行。如果您对染色不满意，或者如果制造商没有提供任何关于工作稀释的信息，您应该尝试1:50到1:1000之间的浓度。具体取决于根据抗体的亲和力，孵育时间可以不同。默认孵育时间为室温下1-2小时；也可以在4°C下过夜孵育。

如果您执行直接如果您可以直接继续样品安装，因为一抗体已经带来了它自己的荧光铬。在间接IF中，二级抗体现在用荧光标记一级抗体。这里的一个关键点是在与一抗孵育后广泛清洗，以减少二抗的非特异性结合。二抗也可在封闭液或洗涤液中稀释。如果生产商没有给出不同的说明，可以先用1:200的稀释剂在室温下孵育1小时。为防止氟铬漂白，必须在黑暗中进行培养步骤。

在免疫反应之后通常会有细胞核染色DNA染料. 一方面，这可以在显微镜下更好地定位细胞或组织切片，另一方面，如果研究人员感兴趣，它可以指示细胞状态（例如有丝分裂）。染料，如Hoechst或DAPI，即使没有渗透也能进入细胞核并插入DNA，用于此。因此，你应该非常小心，避免皮肤直接接触这些染料！用Hoechst或DAPI在PBS中稀释，在室温下进行10分钟的简单核染色。188金宝搏的网址

完成IF程序后，必须安装样品以适合于显微镜。为此目的，使用安装介质（例如moWiol或延长金），其将样品固定在显微镜载玻片上，并且还防止其脱水。此外，安装介质增加折射率，这有利于具有漏油机的显微镜。若干制造商提供与Dabco等添加剂（如Dabco）的安装介质，该抗衰落剂保护样品免受光漂白。取决于所用的荧光染料，一些抗衰落剂比其他抗褪色剂更有效。此外，还提供具有添加DNA染料的安装介质，因此嵌入期间核染色，并且单独的核染色是多余的。如果使用恒定的安装介质，通常是这种情况，则允许样品固化过夜，因此在第二天可以进行微观检查。以这种方式生产的永久制剂可以在室温或4°C下实际上无限地储存在黑暗中，但请记住，荧光致荧光强度随着时间的推移而减少。

对免疫荧光至关重要的是适当的控制，以正确解释你的显微镜图像。缺少或不正确的控制通常会导致错误的阳性陈述和不正确的数据。首先，你应该分析一个只经过固定、渗透和阻断的样品，以了解自身荧光打字错误3/细胞隔室的结构。有时结构显示出高荧光，即使IF没有染色。

作为进一步的控制和调整间接IF的显微镜参数，使用同样经过上述处理的样品，但还与二抗(ies)一起孵育过。首先，这将揭示二抗对标本的强非特异性结合。其次，设置显微镜参数，使该控制在图像采集过程中不记录信号。该设置被用作后续采集的阈值，以排除二次抗体的假阳性信号。直接地，如果自荧光控制用于调整阈值。接下来，分析与一抗和二抗共同孵育的样本，如果是间接IF，还要分析二抗。现在应该可以检测到一个荧光信号，它位于自体荧光和二抗阴性对照之上。

为了确保第一个抗体只标记所需的结构，一些制造商为第一个抗体提供了一种阻断肽，它可以掩盖特定的抗原，从而阻止抗体与其抗原表位结合。这更贵，但也是确定抗体特异性的最好方法，因此得到可靠的结果。在多色IF实验中，还必须注意所选荧光色之间的串扰。如果第一次进行多色If，建议在单独的制剂中对目标结构进行额外染色，并将这些图像与多色图像进行比较。最后，你应该仔细查看获得的数据，并将其与你的预期和相同一抗的现有数据进行比较。

表3：哪个控件要测试什么？

如前所述，IF有许多优点，但也有一些缺点。一个关键点是样品的固定:固定意味着杀死，所以活细胞成像不再可能。因此，动态过程的分析是复杂的，因为每个时间点都必须对细胞进行固定和染色。因此，快速的动态过程不能被IF观察到。这显然是具有荧光标记的融合蛋白表达的优势，如GFP.，适用于活细胞成像。如上所述，IF过程(固定/渗透)改变了细胞结构，因此伪信号可能被解释为假阳性信号。因此，为每个IF染色准备适当的控制是必要的，这可能是耗时的。另一个缺点是不可避免的:荧光色素的光漂白。荧光蛋白喜欢GFP.也会受到影响，但如果储存在适当的条件下，GFP.即使经过几个月的长期准备也能检测到。相比之下，如果荧光色素失去它们的强度更快，这反映在样品在显微镜下的快速漂白。即使是使用防褪色剂的媒体也只能起到暂时的作用。

IF过程的持续时间:5个小时。

这是用化学交联剂固定盖玻片上培养细胞间接IF的标准方案。

• 潮湿的室是适用于IF程序的完美，可以轻松自制（参见幻灯片“如何准备加湿室”）。它可以防止干燥制剂并允许在黑暗中孵育，这对于处理荧光染料并且已经存在的荧光蛋白是必要的。
• 以盖玻片完全润湿的方式选择卷。确保样品从未完全运行干燥。
• 所有孵化步骤都在室温下进行。

幻灯片：如何准备加湿室。

洗涤缓冲器

• 1×PBS（磷酸盐缓冲盐水）

  • 137 mm：NaCl
  • 2.7 mm：KCL
  • 10毫米：不适用₂HPO₄
  • 1.8毫米:KH₂阿宝₄

• 用盐酸将pH调至7.2-7.4

• 在PBS⁺⁺加入最终浓度为1mm的CaCl₂和mgcl.₂

• 对于PBS-T，添加最终浓度为0.05%吐温20
  
  

固定的缓冲区

• 甲醛：

  • 将4%的PFA（多聚甲醛）溶解在温暖（50–70°C）的dH中₂O在pH为8时(用NaOH调节)。
  • 在最终浓度为1 × PBS的基础上加入10 × PBS(例如在900 mL 4% PFA/dH中加入100 mL 10 × PBS)₂o）。
  • 用HCl调整pH至7.2-7.4。

• 甲醇(预冷至-20°C):

  • 100%甲醇（–20°C）

• 甲醇/丙酮(预冷至-20°C):

  • 50%甲醇(-20°C)和50%丙酮(-20°C)
    
    

透化作用缓冲

• tx - 100 (Triton x - 100):

  • PBS最终浓度为0.1％TX-100

• 皂甙：

  • 终浓度为0.1%皂苷的PBS

• 其他洗涤剂也可在PBS中以同样的浓度使用。
  
  

阻塞缓冲区

• 牛血清白蛋白:

  • PBS，最终浓度为1％BSA

• 牛奶粉：

  • 最终浓度为1%奶粉的PBS

• 正常血清:

  • PBS最终浓度为5％正常血清
    
    

核酸染料

• 赫斯特或DAPI:

  • 在PBS中制备Hoechst 33342或DAPI溶液，最终工作浓度为1µg/mL。