介绍
广域显微镜的特点是对完整的标本进行照明，而不同于一般显微镜共聚焦显微镜只有小点照亮的地方。它的变体，特别是宽野外荧光显微镜，是生命科学中最应用的技术之一。例如，检测各种各样的荧光标记在标本固定的或活着 - 可以在许多生物学过程中提供洞察，例如人类免疫系统。
人体在微生物入侵时表现出先天和适应性免疫反应。随着时间的推移，适应性反应会发展出高度特异性的反应，而先天性反应则会对病原体上发现的特殊结构立即做出反应。它们被称为病原体相关分子模式(PAMPs)。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁特有的，是这种模式的一个典型例子。LPS与人类细胞表面的一种特殊受体toll样受体4 (TLR4)结合。一旦结合，它可以触发一个细胞内过程，最终产生被称为细胞因子的促炎蛋白(图1)。
在这种细胞内方法期间的一步是将蛋白质NF-κB从细胞质转移到细胞核中。在其作为转录因子的作用中，NF-κB支持相关细胞因子基因的转录。所产生的细胞因子随后迅速促使白细胞（白细胞）释放可杀死细菌和病毒的反应性氧物质（ROS）和反应性氮物质（RNS）。不幸的是，ROS / RNS也会导致抵押品损伤，并且可以对细胞本身产生负面影响。由ROS / RN损伤，组织细胞释放所谓的损伤相关分子模式（潮湿），本身可以触发TLR，再次启动整个过程并导致慢性炎症。This auto-amplifying toll-like receptor radical cycle (TLR radical cycle) can be associated with a number of diseases such as Parkinson’s disease, stroke, depression, (auto)immune disorders, or chronic obstructive pulmonary disease (COPD), to name but a few[1,2]．
除了上述潮湿的内在激活之外，还存在源自其他过程的物质以启动循环。实例是促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子α（TNFα），RO如H.2O2由进一步的细胞过程产生，以及自由基诱导辐射。
可以使用倒的研究显微镜支持解除炎症的分子过程。本文介绍了我们团队的Widefield显微镜的相关性。最初我们考虑了购买共聚焦激光扫描显微镜。相反，与阔地荧光显微镜结合使用去卷积被选中是出于实际原因，比如学生参加小组的训练时间很短，只有有限的时间。此外，宽场荧光显微镜具有很好的活细胞成像能力，适用的光强度相对较低，从而降低了细胞的应激。
一种配备各种荧光滤清器立方体，专用物镜，快速滤网，气候控制和方便的成像软件的宽阔的显微镜可以在TLR自由基循环的许多方面上脱光。从普通的BrightField显微镜直到免疫荧光实验，和活细胞和呋喃成像，我们可以调查重要的现象，例如动物中受影响组织的命运，触发TLR4具有LPS和随后的NF-κB易刻的NF-κB至细胞核和ca2＋反应炎症。
材料和方法
细胞培养。对于NF-κB的免疫荧光成像，使用用人TLR4，MD-2和CD14稳定转染的HeLa细胞。细胞在补充10％的DMEM（Dulbecco的改性鹰培养基）中培养细胞FCS.（胎牛血清）和抗生素，根据制造商的说明。对于显微镜实验，将细胞接种在玻璃盖玻片上，并在达到60-80％汇合后用于实验。
成像。所有的图像都是在徕卡DMI8倒置显微镜使用徕卡应用程序套件x（拉斯X）软件，搭载用Leica DMC2900彩色摄像机，用于组织学样品和一个滨松Flash4的氯SCMOS相机荧光成像。为了进行活细胞实验的孵育室附着到显微镜主体供给5％CO2和37°C。用嵌入的自动算法执行盲解码卷积拉斯X成像软件。
NF-κB的免疫荧光动力学。对于NF-κB易位试验，接种在盖玻片上的细胞用50ng / mL的LPS刺激60分钟。刺激后细胞用PBS中的4％甲醛固定（磷酸缓冲盐水; 1×与钙和镁; pH值7.0-7.2）。然后，固定的细胞进行染色的RelA（也称为P65）NF-κB-使用初级抗体和Alexa的Fluor568偶联的二抗的-a亚基。为了确定核领域细胞DAPI进行复染。以显现骨架，Alexa氟488鬼笔环肽用于染色肌动蛋白丝。样品嵌入在延长黄金抗淬灭试剂和成像用Leica HC PL7月CS2 63×/1.40油物镜。
瞬时转染HeLa细胞GFP.-rela。为了观察体内NF-κB易位，Hela细胞瞬时转染GFP.- 使用电穿孔的rela质粒。GFP.-RelA来自华纳格林的礼物（Addgene公司质粒＃23255）［3］．电穿孔后，将细胞悬浮液转移到含有细胞培养基的玻璃底盘中。转染后二十四小时，使用Leica HC PL在显微镜下检查细胞7月CS2 63×/ 1.40油物镜和2×2像素合并相机。的图像被刺激细胞与TNF-α（10毫微克/毫升）后取出每五分钟。
呋喃成像。对于钙测量，使用Fura-2AM（Sigma-Aldrich）。该Fura-2衍生物（乙酰氧基甲基）是膜可渗透的并且能够进行比例实验。将HeLa细胞与Fura-2AM（1μm）一起温育30分钟。根据其钙地位，Fura-2有两个激励最大值。钙的呋喃-2在340nm和380nm处令人生畏340nm和Fura-2。发射最大值在两种情况下为510nm。对于比例实验，在340nm和387nm激发后测量荧光发射强度，通过使用快速过滤轮进行。对于340nm的最佳照射，使用液体HC PL氟磷（340）20×/ 0.80油目的，使用低于340nm的优化传播。对于液体施加液体，使用定制的微二磷剂。使用图像采集和比率测量拉斯X软件。呋喃成像和活细胞成像实验是在定制的塑料标本架的帮助下执行，这是为了舒适的标本替代品生产。在圆形覆盖玻璃上生长的细胞可以在样品支架的两半之间拧紧并用液体覆盖（图2）。
组织学。C57BL / 6小鼠在4周龄，收到1.5％DSS（葡聚糖硫酸钠）溶解在饮用水中10天。之后，处死动物，收集组织学的部分结肠。根据常规实验方法将结肠样品用组织嵌入中心Leica Eg1150加工并嵌入石蜡中。使用Leica RM2255 Mictotome和Leica Hi1210水浴切割链烷烃块切割4μm薄切片。然后，将该部分置于显微镜载玻片上，并使用标准方案用苏木精和曙红（HE）染色。
在显微镜下，用Leica HC PL Fluotar 20×/ 0.80油目标检查他的部分。根据样本大小，对控制的10个单块扫描扫描和21个单瓦片扫描，每个幻灯片处理的DSS处理的小鼠并使用该扫描拉斯X软件。图7显示了每种情况下2 × 2幅图像的摘录。所有动物实验均在美因茨大学医学转化免疫学研究所Schuppan博士教授的实验室进行。按照德国和欧盟的规定，包括执行欧洲理事会指令2010/63/EU的《德国动物福利法案》，小鼠被安置、治疗和牺牲。
结果
NF-κB在LPS刺激后对核的易位。炎症是由模式识别受体(PRRs)激活的信号级联所触发的过程(图1)。其中一个PRRs是toll样受体4 (TLR4)。在LPS结合后，TLR4复合物诱导细胞内信号网络，最终激活转录因子NF-κB。然后转录因子从细胞质转位到细胞核并促进促炎细胞因子的表达［４］．
可以使用荧光显微镜研究与核的NF-κB易位的过程。为此目的，用TLR4构建体稳定转染的Hela细胞暴露于LPS 60分钟。固定后，NF-κB的亚基 - 是免疫染色的。作为对照，还标记了非刺激的细胞。
在非刺激的细胞中，NF-κB（洋红色）主要位于细胞质（图3）中。在用LPS刺激60分钟的NF-κB后易转化为细胞核。绘制NF-κB通过一个细胞的强度分布证实，可以在细胞核周围成像非刺激细胞中的最高量的NF-κB。尽管如此，可以在核内部检测低NF-κB信号，这可能是由于核心高于和下方的NF-κB分子的焦点。使用共聚焦显微镜获取薄型光学部分可能会减少这种情况。
反褶积是另一种避免因失焦而产生误解的方法。宽视场显微镜不仅能探测聚焦面上的光，还能探测来自其他区域的散射光。一种反褶积软件算法可以帮助将荧光信号重定向到它们的来源。图4显示了这种方法。免疫染色的HeLa细胞在荧光显微镜下成像，然后在成像软件中集成反褶积。与原始图像相比，反卷积图像在保留定量数据的同时显示了更清晰的细节。因此，可以更精确地确定NF-κB分子的位置。
可以想见，这些荧光显微术为基础的图像可以通过温育后在不同时间点固定细胞，测定NF-κB的细胞核和细胞质之间的比率被用作易位试验。在这样的测定，抗炎部件可以被测试，例如。潜在的物质可以被添加到细胞培养物中，并且可以直接观察到其对NF-κB转位的影响。相较于其他基于筛选的方法，这将给在单细胞水平的信息。
通过用荧光标记的蛋白质转染细胞，还可以通过活细胞成像检测目的蛋白质的动力学。为此目的，用NF-κB亚基Rela转染HeLa细胞GFP.．除LPS外，还有其他刺激因子可促使NF-κB易位入核。其中之一是TNFα。因此，转染后的HeLa细胞在活细胞成像前使用TNFα处理(图5;点击这个网址观看本期电子版的在线视频:http://dx.doi.org/10.1017/S1551929516000894)。
可以看出，在用TNFα刺激时，核中NF-κB浓度严重增加。20分钟后，大多数转录因子已被易用。有趣的是，在达到这种峰后，NF-κB开始重新分裂到细胞质。
建立上述荧光显微镜测定以使用NF-κB作为炎症的指示。它们可用于测试细胞培养系统中的促药和尤其是抗炎物质。这可能会发现慢性炎症的潜在治疗方法。
炎症期间的电信号。炎症反应与内细胞和细胞间电信带连接。离子通道高度涉及炎症，它们的表达和功能可以受到LPS的影响[5,6]或细胞因子和趋化因子[7]．因此，除了上述NF-κB易位测定之外，测量离子信号还可以深入了解Pro的效力以及抗炎刺激。通过量化钙，钠和钾离子的细胞内浓度变化，可以研究刺激炎症的两种物质以及如何中断该过程。
细胞内钙浓度可以间接地使用荧光Ca成像2＋指标。通常，离子敏感的荧光染料可逆地与特定离子结合并在结合时改变它们的荧光特性。其中一个是Fura-2，属于“双激发离子指标”。
根据其绑定状态，它会更改其激励最大值。加利福尼亚州2＋未绑定的形式在380 nm和ca兴奋2＋340 nm的绑定形式。通过测量510nm的荧光强度比，可以结束CA2＋回复。使用Ratiometrics避免与呋喃-2浓度或细胞厚度局部差异相关的不精确性[8]．
为了建立实验室中的比例成像的方法，为Hela单元设置了一个协议以及包括定制微探测器的特殊硬件设置。使用ATP刺激而不是炎症的易于访问的例子，可以实现细胞电反应的首先测量。这里，ATP用于挑选通过在细胞表面上的普遍地表达的P2Y受体满足的典型生理反应。该嘌呤能受体将钙渗入内质网（ER）触发到细胞溶质中，然后可以通过Fura-2检测。图6显示了上述比例实验。
加入ATP后，载钙FURA-2 (ex 340 nm)的荧光强度增加，而无钙FURA-2 (ex 387 nm)的荧光强度降低。刺激后约100秒，钙被转运回ER, FURA-2荧光活性处于原始状态。
随着比例成像的选择，可以研究炎症期间钙电位的作用，并分别用作炎症的指示剂。例如，可以用这种模型检查局部麻醉剂的抗炎能力。
在荧光显微镜下观察活细胞需要特殊的成分来维持它们的存活，并使它们处于接近自然的条件下。例如，在孵育室中，可以控制适当的环境温度。为了研究在盖片上连续生长的几个样品，使用了一个定制的样品固定器(见图2)。借助这种结构，可以成像活细胞。对于活细胞成像或FURA成像的使用，盖卡瓦可以很容易地更换。
小鼠溃疡性结肠炎的研究。溃疡性结肠炎包括结肠的慢性炎症。病人经常腹泻，夹杂血液。慢性失血会导致贫血，这些人患结肠直肠癌的风险更高。
因为溃疡性结肠炎是一种慢性炎症疾病，所以可以假设它与TLR自由基循环有关(9、10)．为了更近距离观察，实验室里使用了一个老鼠模型。有趣的是，将DSS掺入动物的饮用水中，可引发肠道疾病［11］．用这种饮食治疗的小鼠表现出典型的溃疡性结肠炎症状。在明亮的视野下，显微镜可以成像它们的肠组织切片。苏木精和伊红(H&E)染色将细胞核染成蓝色，细胞质染成红色，可用于小鼠结肠的形态学检查(图7)。
与对照组相比，DSS处理的小鼠在粘膜中显示出激烈的病变和整体上皮结构的改变。此外，这些小鼠失去了粘膜的特征性侵略性，所谓的隐窝;通常，它们的粘膜和粘膜肿是通过炎症细胞渗透的。在以前描述的基于细胞培养的系统之上，该小鼠模型揭示了关于生物水平对慢性炎症的结果。
讨论
许多疾病，包括神经炎性疾病例如帕金森氏病或中风，以及全身性疾病，例如，（自动）免疫病症或癌症，与慢性炎症相关联。了解慢性炎症会打开新的大门的分子过程，以应付相关的疾病，并制定自己的治疗策略。
除分子生物学外，宽田显微镜是一个主要工具，可以获得TLR自由基循环的见解 - 慢性炎症的基础。例如，在常规分辨率下施加相对简单的免疫荧光显微镜观察NF-κB在用LPS刺激后从细胞溶溶胶到细胞核中的易位。在其作为转录因子的作用中，NF-κB增强了驱动TLR自由基循环的促炎细胞因子的表达。
有趣的是，不仅LPS能够通过TLR4信号激活开始炎症过程;还有其他可以间接触发TLR4信令的源。这些可以是例如纳米颗粒，过渡金属，半抗生素有机化合物或臭氧，其导致自由基或直接引发潮湿的产生。如上所述，潮湿又可以激活TLR4路径。当然，进一步调查这个过程并进一步调查该过程并破译其背后的机制。
除了探索这种恶性圈子的基本进程外，还有符合人们可以破坏它的方法。携手是观察NF-κB易位的细胞培养模型 - 作为炎症的指标 - 人们可以检查如何停止这种进展。本组目前研究了来自草药提取物的许多物质，以便它们干扰转录因子的易位进入细胞核的可能性。
除了以常规分辨率的宽ffield-荧光技术，使用超分辨率显微镜的方法[12,13]即使是在单分子分辨率下，也可能提供更多关于炎症机制的细节。
除了蛋白质状态外，细胞的离子组成还可以提供有关炎症过程的信息。通常，离子通道对炎症反应，因为它们的表达和功能可以受到细胞因子的影响。此外,钙2＋例如，是否通过炎症小体参与了白细胞介素的成熟[14]．因此，它可以作为炎症进展的指标。当涉及到Ca时，比率FURA成像是一个强有力的工具2＋测量[8]．建立一个可靠的工作系统是进一步破译TLR自由基循环的更多细节以及如何破坏它的基础。在未来，人们可以想象筛选那些对慢性炎症有影响的物质，这些物质是由改变的Ca指示的2＋回复。
此时，应该提到的是，比成像需要快速变化的激发波长或检测到的波长，强光源，光学部件的优异传输，以及快速的信号检测。超快过滤轮的开发，紫外线- 优化的目标，高度敏感的荧光团和快速和敏感的相机（SCMOS）允许在高空间分辨率下定量高速活细胞成像。
除了体外研究外，还可以在整个生物体中研究炎症过程。因此，患有结肠（溃疡性结肠炎）中慢性炎症的小鼠是有趣的研究受试者。在这种情况下，它们的组织学状态可以用作相应组织的炎症等级的指示。在这个阶段，可以在完全的生物体中研究慢性炎症，例如，特殊饮食如何影响溃疡性结肠炎，是消极的或积极的。在未来，由于其氧化地位，染料的使用改变其荧光行为将被用作ROS指标以获得进一步的见解。
结论
许多不同的光学显微镜技术可用于检查底层炎症反馈回路的许多位置处的慢性炎症。对比度方法范围从BrightField到荧光显微镜，具有比例成像的选择。检查样品可以是单个细胞或整个器官的大小。可以观察到固定细胞和组织学部分以及活细胞。有趣的是，对于本报告中描述的方法，研究人员对所有不同技术不需要多个显微镜。由于现代生活科学研究显微镜的灵活性和升级性，如徕卡DMI8.，再加上用户友好的成像软件，细胞过程可以从多个方向突出显示。有了这些好处，光学显微镜在生命科学中保持了它的地位，并将继续破译细胞生物学现象，帮助对抗疾病，如慢性炎症。
致谢
Detlef Schuppan博士博士友好地为动物实验提供了他的设施。我们非常感谢Frank Helleis博士，Thomas Klimach博士以及Max Planck化学研究所的制造自制样品架的化学研究所的研讨会。Frationally承认支持ulrichpöschl博士和最大普朗克社会。
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