第七届欧洲超分辨率用户俱乐部会议摘要

帕维尔是一名细胞和分子生物学家，曾在莫斯科国立大学(Moscow State University)学习生物学，随后在牛津大学(Oxford University)邓恩病理学院(Dunn School of Pathology)和捷克斯洛伐克科学院(czechoslovakia Academy of Sciences)实验医学研究所担任研究职位。自2006年以来，他一直担任捷克科学院分子遗传学研究所细胞核生物学系主任，并自2015年以来担任显微镜中心主任。他在包括《细胞》、《自然》、《细胞生物学》和《科学》在内的主要期刊上发表文章。他在查尔斯大学讲授细胞和分子生物学、医学生物学和显微镜学。188bet怎么注册他也是捷克生物成像和欧洲生物成像的国家协调员。

主要研究课题:

• 细胞核高阶结构的定义;核区域化形成机制
• 核骨架的结构、动力学和功能
• 基因表达的表观遗传调控核结构的鉴定
• 肌凝蛋白I、肌动蛋白和肌动蛋白结合蛋白的核功能特征
• 核磷脂在染色质功能中的定位和功能
• 显微学新方法的发展

在ASCR分子遗传学研究所细胞生物学系，Hozák教授长期从事与细胞核相关的研究，特别是控制基因组功能的模式，因为它们的破坏会导致基因活性的不平衡和严重疾病。在Hozák教授团队的重要发现中，已经发现基因的阅读是由肌凝蛋白分子和一些脂类辅助的。他的团队还致力于改进电子显微镜方法，将科学研究的可能性转移到细胞结构上。Hozak教授为一组不同形状的纳米粒子申请了专利，使其能够识别细胞中不同分子的位置，否则使用标准纳米粒子是不可能的。

核外周是分隔细胞核和细胞质的复杂环境。它由双核膜和驻留的内膜蛋白组成，内膜蛋白位于核层下，并由核孔复合物穿孔。在脊椎动物中，核层由两种层板组成——A型和b型层板，它们形成独立但相互连接的网络。核层参与细胞的机械感测、核的形状决定和应变抗力。重要的是，它在染色质的组织和相应的过程中起作用，包括DNA复制、修复或翻译。核层与基因贫乏的异染色质区域有关，而非染色质被认为是转录活性和开放染色质的岛屿。

我们已经使用了超分辨率显微镜(SIM和st)和随后的图像分析，以分辨核孔复合物和核层周围染色质组织的更精细的特征。进一步，我们跟踪了缺乏核孔复合体蛋白TPR的细胞中的A-和b型层膜组织，结果表明，大部分核孔复合体篮子的缺失对核外围染色质的排列以及层膜网络的结构特征具有更广泛的影响。

细胞的内部空间充满了一组脚手架和结构聚合物网络。通常被称为细胞骨架，它们为细胞内运输提供通道(微管)，维持细胞形状(中间丝)和驱动细胞运动(肌动蛋白丝)。单丝的厚度在8-20 nm范围内，远低于衍射极限。本次演讲将展示使用一套超分辨率技术(st，风暴，膨胀显微镜及其组合)。

在各种细胞模型中(从成纤维细胞到神经元和上皮细胞)，这些结果为细胞器定位、运输组织和内部病理改变的机制提供了见解。我将展示我们在推动多色、3D、大视场、实时和“最高分辨率”显微镜成像时的最佳尝试、缺陷和实际限制。

定位显微镜是一种强大的工具，可以在几十纳米的长度范围内成像结构，但它在活细胞成像方面的用途受到时间的限制，因为它需要获取超分辨率图像所需的数据。通过使用先进的算法，可以分析密集的数据，权衡采集和处理时间，可以将采集时间缩短两个数量级以上。

使用隐藏马尔可夫模型对整个定位显微镜数据集建模，可以从极为密集的数据集中提取定位信息。这种闪烁和漂白的贝叶斯分析(3B)能够在几秒钟的时间尺度上对活细胞的动态过程进行成像。3B在各种活细胞系统上的性能被证明，包括心肌细胞和足突体，显示了几十纳米的分辨率，采集时间可降至每秒。

在分析较高的密度图像的同时可以提高获取超分辨率重建所需数据的速度，仍然存在可以实现的速度。与常规荧光显微镜不同，这些限制不仅通过显微镜的性质设定，而是由样品本身的结构确定。这是因为本地样本结构会影响创建特定分辨率的图像所需的信息的快速可以通过光学系统传输。将讨论理论限制，并证明了对活细胞实验的影响。

生物医学研究的主要目标之一是了解人体有效功能背后的分子过程的复杂相互作用。188bet怎么注册在科学上，应用的观察方法在观察过程中不影响生物系统是很重要的。能涵盖所有这些的最合适的工具是光学远场荧光显微镜。然而，生物医学应188bet怎么注册用往往需要覆盖大范围的空间和时间尺度，以及/或较长的采集时间，到目前为止单个显微镜无法覆盖所有这些，这给显微镜基础设施带来了一些挑战。

以免疫细胞反应和质膜组织为例，我们概述了这些挑战，但也为这些先进的显微镜技术的可能解决方案和潜力提供了新的见解，例如解决脂膜筏等长期存在的问题。

在简短介绍了显微镜和st，讨论一些2D-的例子st在组织学样本和微泡上，快速切换到特定的应用，即围绕3T3细胞细胞核的层压结构的成像。

分辨率的差异将得到验证，证明该技术在生物学研究中的收获。未来研究的可能性将被指出。

淀粉样蛋白-β (Aβ)斑块由不同种类的Aβ多肽从单体、低聚物到大原纤维的聚集物组成。这些斑块代表了阿尔茨海默病(AD)的核心神经病理学特征之一。然而，在人类大脑中，研究这些聚集已经被证明是具有挑战性的。这是因为可以从样品中收集到的详细结构的三维信息受到光的衍射极限的大小限制。此外，光学像差和散射使得成像大脑内部聚集的平面变得困难。

在这项工作中，我们提出了阵列层析显微镜(ATM)和st显微镜。这为各向同性的3D信息提取，其分辨率最高为80nm，而不会被聚集体的光学性质损害。我们将看到这种方法在研究广告中Aβ肽的聚集以及其低聚形式（OAβ）的作用研究的应用，这被认为是与突触毒性和损失相关的最有害物种。

活细胞st使用FPs的显微镜通常会受到EGFP不能很好地显示许多横截面的事实的阻碍st耗尽激光器通常用于黄绿色的发色团在大约。590海里。EYFP及其衍生物在这个波长上显示出更好的横截面，但其缺点是易于漂白。为了克服这些问题，我们使用了mNeonGreen©，发现它比EGFP和EYFP都要好，可能是由于一些特定的特性。首先，它明显比EGFP和EYFP更亮，其次，它的荧光比EGFP红移，因此在耗尽激光下比EGFP有更好的横截面。我将介绍几个使用mNeonGreen在转染细胞系中成功活细胞成像的例子。

在几乎所有的真核生物中，线粒体都维持着自己的基因组。尽管早在50多年前就发现了这一发现，但关于细胞分裂期间基因组是如何正确分离的仍然知之甚少。原生动物寄生虫布鲁氏锥虫含有单个线粒体和单个基因组，即运动质体DNA (kDNA)。电子显微镜研究显示，在细胞周期中，三重附着复合物(TAC)将kDNA物理连接到鞭毛的基底体，并通过基底体运动确保线粒体基因组的适当分离。

使用超分辨率显微镜，我们精确定位每个目前已知的独特TAC组件。我们证明了TAC从鞭毛底部到线粒体基因组按层次顺序组装，而且组装不依赖于kDNA本身。

从海洋无脊椎动物到人类，各种后生动物中都发现了具有多条运动纤毛的细胞。中心粒的大量产生是多毛细胞形成的早期步骤，中心粒转化为基底体后成为纤毛的锚定单位。mcc中的大多数中心粒是由一种特殊的结构产生的，这种结构被称为氘核体，直径只有几百纳米。

在它最初被描述40年后，人们对氘核体的组成、结构和规则知之甚少。我将介绍我们识别氘核体成分的策略和方法st显微镜为我提供了一个强大的工具来处理它的组织。