探索超越衍射极限
尽管传统的荧光显微镜获得了很多深刻的见解，但在研究亚细胞结构时很容易受到挫折，因为感兴趣的生物实体往往明显小于衍射极限。在传统的远场荧光显微镜下，无法分辨距离小于200纳米的物体，感兴趣的细节在模糊中丢失。一些远场超分辨显微镜的方法克服了这一基本障碍，并允许形态学细节的研究远远超出衍射极限。受刺激排放耗竭(发生的)成像(1]，作为共聚焦激光扫描显微镜，移动一个激发光点在样品上，检测发射的荧光，并一个像素一个像素地产生所观察的光学切片的图像。
为了实现超分辨率，衍射有限的激励光斑被第二束激光器的甜甜圈形状的点扩散函数覆盖发生的激光。一个被称为受激发射的过程可以防止染料在焦体积的任何地方发射荧光，除了甜甜圈的中心。有效聚焦被缩小的程度，即所能达到的分辨率，取决于聚焦的强度发生的激光和染料。与商业可用发生的-显微镜，低于60 nm横向分辨率通常用Atto 647N。共焦和发生的显微镜是一个完美的匹配，可以很容易地实现在相同的设置。通过可用的商业实现，用户可以在共焦和发生的通过单次鼠标点击的分辨率。
尽管传统的荧光显微镜获得了很多深刻的见解，但在研究亚细胞结构时很容易受到挫折，因为感兴趣的生物实体往往明显小于衍射极限。在传统的远场荧光显微镜下，无法分辨距离小于200纳米的物体，感兴趣的细节在模糊中丢失。一些远场超分辨显微镜的方法克服了这一基本障碍，并允许形态学细节的研究远远超出衍射极限。受刺激排放耗竭(发生的)成像1，作为共聚焦激光扫描显微镜，移动一个激发光点在样品上，检测发射的荧光，并一个像素一个像素地产生所观察的光学切片的图像。
为了实现超分辨率，衍射有限的激励光斑被第二束激光器的甜甜圈形状的点扩散函数覆盖发生的激光。一个被称为受激发射的过程可以防止染料在焦体积的任何地方发射荧光，除了甜甜圈的中心。有效聚焦被缩小的程度，即所能达到的分辨率，取决于聚焦的强度发生的激光和染料。与商业可用发生的-显微镜，低于60 nm横向分辨率通常用Atto 647N。共焦和发生的显微镜是一个完美的匹配，可以很容易地实现在相同的设置。通过可用的商业实现，用户可以在共焦和发生的通过单次鼠标点击的分辨率。
实现2C共焦超分辨率
发生的显微镜允许快速和无偏见的信息获得的结构和组织的生物实体感兴趣。下一步是将这些信息放到上下文中。通过探索一种分辨率为60纳米的结构和同时成像几种共聚焦染色剂，我们已经了解了很多。然而，在有限的次衍射细节中观察两个结构是如何相互组织的，这为共局域化研究打开了一扇全新的大门。
实现两种颜色的两种方法(2C)发生的图片已被报道。第一种是技术上的要求，使用两套独立的激励和发生的两种光谱分离染料的波长[2第二种方案(“一圈方法”)使用标准荧光团(Stokes shift 10-30 nm)与大Stokes shift染料(例如，Chromeo 494的>100 nm)的部分重叠发射光谱[3.]．这只允许使用一个发生的激光。利用激发光谱的差异来区分这两种染料。为了生成2C图像，在每一帧中使用不同的激励激光线记录两帧。用正确的染料组合和平衡的染色，就能达到2C发生的图像是按照这种方法收集的，即使是在两个通道检测到相同的频带。当然，发射光谱的差异也可以用来帮助区分染料。应用相同的优点发生的甜甜圈的超分辨率通道不仅降低了系统的总体成本和复杂性，而且还避免了色差问题，这是其他超分辨率显微镜实现需要补偿的。
图2:共定位研究的新质量。共焦(左)和发生的相同结构的图像(右)。860纳米的强度曲线如下所示。染料:Chromeo 494(绿色);阿647 n(红色)。
为纳米尺度的共定位研究提供标准工具
两种共聚焦超分辨系统(脉冲型和cw型)都能在100纳米范围内进行共定位研究。为此，在640nm的脉冲线之外，还引入了531 nm的第二激励激光器发生的该系统利用脉冲激光在深红色范围内实现共聚焦纳米成像。此外，还为推荐的染料对Chromeo 494/Atto 647N设计了一个用于高灵敏度雪崩光电二极管探测器(APDs)的特殊滤波器立方体。这保证了最佳的染料分离，而不需要后处理。
cw版本使用连续波激光器发生的在可见范围内成像。它促进了与绿色标准染料的共聚焦纳米技术，例如Alexa 488, Oregon green 488，FITC以及自荧光蛋白(FPs)，如eYFP、Citrin和Venus。一个新设计的目标- HCX PL7月油100 x 1.40 na发生的橙色-允许cw版用户自由选择任何氩线(458,476,488,496,514 nm)与592 nm激光器一起进行激发发生的．因此，许多染料和荧光蛋白组合已经应用于2C共聚焦纳米技术。
获得了优秀的2C图像，例如用BD Horizon V500和Oregon Green 488染色的样本，没有通道间的串音。荧光团组合显示出更大的光谱重叠，也产生了良好的结果后，染料分离与适当的软件包。随着染料和荧光素的增多，特别是在可见光范围内，越来越多的荧光团组合将被证明是有用的多色共聚焦纳米技术。
结论
光学切片能力的共聚焦显微镜推动共定位研究到一个新的水平。然而，衍射限制的分辨率常常掩盖了记录z-堆栈中重要的亚细胞细节。完全嵌入在最先进的共聚焦仪器，多色发生的缩微拷贝可以快速、公正、容易地获取细胞、组织甚至生物体的光学切片中的隐藏形态。多色共聚焦纳米系统使生命科学研究人员能够探索超越衍射极限的细胞结构。
参考文献
- 地狱SW和Wichmann J: Opt Lett 19(1994) 480 - 82。
- Donnert G等人:生物物理学报92:8 (2007)L67-9。
- Schmidt R等人:Nat Methods 5:6(2008) 539-44。