宽田显微镜越来越熟悉厚生物标本的3D图像

每个荧光显微镜使用者都想要获得尽可能多的感兴趣结构的详细信息。这里的问题在于光学系统产生逼真图像的能力有限。所有光源，如标本内的荧光蛋白，都发出散射光。在实践中，散射会导致信号模糊，这取决于样品的厚度。为了克服这个问题，人们开发了不同的方法。

共聚焦显微镜通过使用激励和排放光通道中的针孔的复杂定位来排除焦点外信息[1]．该方法导致大的垂直（Z）分辨率（小焦深），并消除了焦点超信号贡献。由于样本的每个可视化点的共焦体积小（光学切片）[1,2]，在收集样本的所有光学部分之后创建最终图像。因此，通过较长的图像采集时间抵消了更高分辨率的好处。

传统的宽场显微镜没有针孔并收集焦点和焦点灯光信号［3］．它提供了快速的图像采集，但分辨率较低。

要了解如何在宽泛的图像中解决模糊性的这个问题，通过观察非常小的样品，如圆形乳胶珠，它具有比显微镜的分辨率极限的尺寸开始。在横向（XY）方向上用显微镜观察该3D荧光样品，观察者看到发光点的投影，用模糊的周围（图1）。在以下描绘中获取Z堆叠的结果：珠子的侧视图类似于站在彼此顶部的两个锥体。该结果是由于在Z堆采集期间记录的杂散光。可以从信号数据中减去这种“假”信息，使得产生真正代表实际珠的图像。该减法是在称为解卷积的数学计算的帮助下完成的(4、5)．

要了解此程序的基础知识，有必要介绍一项特殊的术语，这些术语通常在折叠卷积时使用：点传播功能（PSF）(4、5)．

原则上，图1所示的畸变现象源于光学显微镜产生点光源代表图像的能力有限。通过显微镜透镜的光信号会根据光学系统的设置、光的波长、物镜及其数值孔径(NA)、浸没介质的折射率和其他参数而发生畸变。所有这些影响的结果——关于它们对光学系统产生的最终图像的影响——被描述为点扩散函数(图2A和2B)。在物理术语中，我们可以把样本想象成PSF的卷积(折叠)。同时，通过了解PSF，就有可能从PSF“展开”样本。这种“展开”称为反褶积。

现在的问题是:如何确定PSF?PSF通常是通过计算来估计的。当提供显微镜物镜的激发和发射波长峰和数值孔径(NA)等信息时，可通过计算机算法计算PSF的理论值。

的雷霆成像仪徕卡微系统(Leica Micr188金宝搏的网址osystems)的技术提供了厚的生物标本的实时图像，具有强烈的对比度，没有雾霾或广域系统典型的失焦模糊。它使用了一种名为“计算清除”的方法，超越了反褶积方法[6]．计算清除检测并实时地从对焦区域中移除不需要的信号，并且清楚地揭示了来自焦点兴趣区域的所需信号。它通过标本特征的大小的差异来区分焦点和焦点信号。特征大小和所有相关光学参数都会自动考虑。计算清算方法成功可视化了具有敏锐的焦点和对比度的细节，这些样品通常不适合用标准宽FIFE系统的成像。此外，它可以与图像恢复方法组合。要了解更多关于雷霆技术和计算清算工作的信息，请参阅此技术注意．