三维点扩展函数(PSF)和全宽半最大值(FWHM)
由光学系统产生的点(点)像称为点扩散函数(PSF)。点扩散函数描述了从无量纲光斑发出的光在三维空间中的分布。这个衍射图案的核心是椭球形的，这就控制了光学分辨率。径向尺寸决定横向分辨率;轴向尺寸决定了焦点深度，从而决定了切片性能。
对于共焦切片，目标是只传输PSF的内核，它定义了光学切片。事实上，针孔的直径控制着多少光从外芯被传输。因此，衍射图案大小范围内的光学部分显然不是像面包片那样边缘锋利，而是具有相当平坦的斜度。连接强度剖面两侧50%强度的距离以z为单位称为“全宽半最大值”(FWHM)，按照惯例，这被用作光学截面厚度的测量。光学切片性能通常是通过在z中模拟无限薄结构的面镜进行聚焦来测量的。这种方法(相对而言)简单，可用于检查共聚焦显微镜系统的性能。另外，更实际的是，z切片性能是用氟铬化乳胶珠测量的(见图1)。荧光珠允许在非相干条件下测量性能，这对于荧光成像是正确的，因此适合生物医学领域的绝大多数共聚焦应用。188bet怎么注册在反射光模式(反射镜)下，衍射限制的光学部分明显薄于荧光模式下。在比较文学作品中的数字时，记住这一点很重要。
控制光学切片厚度的参数
在理想条件下，可实现的最薄截面仅取决于光学衍射的限制。最明显的是波长，它按比例控制PSF的大小：波长越短，切片越薄。我们可以假设激发光的波长是有限的（而不是发射的波长），因为不会有来自被照亮空间之外的发射。第二个参数是物镜的孔径（数值孔径，NA）：NA越高（收集信息的角度越宽），光学部分越薄。此外，样品的折射率影响轴向分辨率，从而影响切片性能。图2的公式给出了切片大小dz与这些参数的关系。
第三个参数是检测路径上的针孔直径，根据上面的公式，假设针孔直径为零。因此，这个公式给出了人们可以期望的荧光成像的最佳值——当然只是理论上的兴趣:一个直径为零的针孔不会产生明亮的图像!
光学切片厚度的关键评论
数值孔径NA对切片厚度有显著影响（1/平方）。psf的径向延伸与NA呈线性关系。因此，对于低钠透镜，PSF芯变得非常细长，切片非常厚。因此，大多数应用使用NA>1的浸入式透镜，其中xy和z尺寸的比率接近2的一个因子。根据经验，高NA透镜的z截面大约是xy分辨率的两倍。
理论考虑有助于估计光学系统的性能。实际上，仪器和样本都与计算值有偏差。为了达到最佳性能，必须仔细调整和操作仪器。而样本本身就是分辨率的敌人，尤其是当它涉及到更深的成像时。因此，必须特别注意折射率匹配，正确和恒定的温度和适当的覆盖选择。该理论将给出一个经验法则，但样品和设置可能会带来重大偏差——通常是不可避免的，因为生物样品比晶体(或真空)更复杂。
工具书类
- 扫描光学显微镜。见:Barer R and Cosslett VE (eds)， optics and Electron Microscopy 10(1987)。学术出版社，英国伦敦。
- 威尔逊T：共聚焦显微镜。学术出版社，英国伦敦（1990年）。
- Corle TR和Kino GS:共聚焦扫描光学显微镜及相关成像系统。美国圣地亚哥学术出版社(1996)。
- Borlinghaus RT和Gröbler B.：共焦激光扫描显微镜的基本原理和应用。伊森伯格G（ed）：细胞生物学中的现代光学、电子学和高精度技术，35–53（1997）。斯普林格海德堡。
- Cox G：细胞生物学中的光学成像技术。泰勒和弗朗西斯，美国博卡拉顿（2007）。
