准备固定和染色的影响和随后的协议紫外线激光显微解剖小鼠脑组织部分(事后剖析)RNA质量描述如下。RIN数字cryo-asserved未经处理的大脑的部分与部分相比,治疗根据标准协议和孤立。图1显示了从cryosection RIN分析样品制备流程。
Cryosection后续染色和修复
未经处理的组织样本比较固定和染色的组织样本,三个cryo-asserved小鼠大脑已知RNA的完整性(RIN)。在-80°C cryo-asservation后,这些被转移到一个cryomicrotome和孵化-35°C 45分钟。然后组织平衡在-18°C 30分钟,切成12µm cryosectioning部分在-18°C。小鼠的大脑部分分为两组交替治疗。一个(对照组)直接冻结在-80°C。另一组应用于一个RNase-free,紫外线治疗笔滑动。这是由短暂解冻的部分在室温和修复在75%乙醇为2分钟冷却到-20°C。固定后,他们立即沾滴sterile-filtered甲酚紫(CV)染料溶液在100%乙醇(1%甲酚紫)和孵化为45秒轻微的来回运动。这个染色过程后,染料溶液一度耗尽的下滑是沉浸在一个升序序列乙醇浓度(75%、95%和100%)4秒每个最后固定在100%乙醇(测试组)。这个固定和染色过程后,幻灯片和硅胶干燥在干燥室在室温下45分钟,然后储存在-80°C的干燥箱等待激光显微解剖。
紫外激光显微解剖
固定和染色后,应用组织分离使用的温柔和3技术紫外线激光显微解剖。这是由标志着组织分裂成矩形之前使用10倍的目标完全去除“画+削减”模式使用足够的能量。0.5毫升的收集dissectates RNase-free帽允许净化RNA的内容。这些都是储存在-80°C等待RNA隔离。
平行RNA隔离
两组——未经处理的样品储存在-80°C,固定、染色、激光microdissected样本——并行解冻和同时处理同一个试剂。RNeasy迷你包®公司的试剂盒用于净化、制造商188金宝搏怎么注册的指示。纯化RNA被筛选了30µl RNase-free水倒进新鲜RNase-free试管。
关于RNA质量RIN的比较值
比较本地的RNA质量低温组织部分与CV-stained EtOH-fixed,激光microdissected组织部分,不同处理样品的RNA是应用于同一RNA nanochip(安捷伦生物分析仪)。RNA RNA nanochip分离样品的毛细管凝胶电泳和成绩的质量样品根据他们行动的方式在芯片内。质量表示为一个RIN值:RIN的10表明完全完整的RNA和RIN的1完全退化的RNA。
RIN分析进行了这里(图2)样本测量表明,RNA的RIN值直接从冰冻的本地组织是根据描述那些没多大区别对待紫外线- - - - - -LMD标准协议。
RNA降水
孤立的RNA样品被分成两组,一半是沉淀。RNA后降水(根据指示“提高表达的实时定量rt - pcr分析单个细胞”丽丝,2002),从本地的RIN值组织样本,沉淀低温组织略低于从CV-stained RNA的RIN价值,EtOH-fixed,紫外线- - - - - -LMD对待组织。的差异可以归因于poly-I沉淀——其中一些短线RNA分子混合物纯化和检测芯片和其他RNA在RIN测量算作退化比例的一部分。在qPCR反应poly-I没有负面影响。因此,固定、染色和紫外线激光显微解剖大脑的部分有或没有RNA RNA沉淀不影响质量。图2显示了一个本地的RNA质量比较,固定和染色的小鼠的大脑部分。
总之,这是显示紫外线激光显微解剖与描述的方法(Grundemann et al .,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21761319)不显著影响cryo-asserved脑组织的RNA质量。这种技术提供了一个适当的样品制备方法和非破坏性孤立的单个细胞获得RNA质量不变。
