预备固定和染色方案的影响及后续紫外线激光显微解剖小鼠脑组织切片(事后剖析)对RNA质量的影响如下。将冷冻保存的未处理脑切片的RIN数与按照标准方案处理和分离的脑切片进行比较。图1显示了从冷冻切片到RIN分析的样品制备流程。
冷冻切片，随后染色和固定
为了比较未处理的组织样本与固定和染色的组织样本，我们使用了3个已知RNA完整性(RIN)冷冻保存的小鼠大脑。在-80°C低温保存后，转移到低温切片机，在-35°C孵育45分钟。然后在-18°C平衡30分钟，在-18°C低温切片切成12µm切片。将小鼠脑切片分为两组，交替治疗。1组(对照组)直接在-80°C下冷冻。另一组应用RNase-free，紫外线治疗笔滑动。这是通过在室温下短暂解冻切片，并在75%乙醇冷却至-20°C中固定2分钟完成的。固定后，立即滴入无菌过滤甲酚紫(CV)染料溶液(1%甲酚紫在100%乙醇中)染色，轻轻前后移动孵育45秒。染色结束后，将染料溶液暂时沥干，然后将载玻片浸入浓度依次上升的乙醇(75%、95%和100%)中4秒，最后在100%乙醇中固定(实验组)。在此固定和染色程序之后，载玻片在室温下用硅胶干燥室干燥45分钟，然后在-80°C的干燥盒中保存，等待激光显微解剖。
紫外激光显微解剖
固定和染色后，应用温和无污染的技术分离应用的组织紫外线激光显微解剖。这是通过标记组织并使用10倍目标将其划分为矩形，然后使用足够的能量使用“绘制+切割”模式完全消融它。切片收集在0.5 ml无RNA帽中，用于RNA含量的纯化。将其保存在-80°C，等待RNA分离。
平行RNA隔离
两组——未经处理的样品在- 80°C保存，以及固定的、染色的和激光显微解剖的样品——同时被解冻，同时用相同的试剂处理。RNeasy迷你套件®根据制造商的说明，用于纯化。188金宝搏怎么注册用30µl不含rnase的水将纯化的RNA洗脱到新鲜的不含rnase的试管中。
RNA质量RIN值的比较
为了比较天然冷冻组织切片与cv染色、etoh固定、激光显微解剖组织切片的RNA质量，将不同处理样品的RNA应用于同一RNA纳米芯片(安捷伦生物分析仪)。RNA纳米芯片通过毛细管凝胶电泳分离RNA样本，并根据样本在芯片中的移动方式对其质量进行分级。质量用RIN值表示:RIN值为10表示完全完整的RNA, RIN值为1表示完全降解的RNA。
这里进行的RIN分析(图2中的样品测量)显示，直接冷冻的天然组织的RNA的RIN值与根据上述方法处理的RNA没有太大的差异紫外线-LMD标准协议。
RNA降水
将分离的RNA样本分成两组，其中一半进行沉淀。RNA沉淀后(根据给出的说明改进的实时定量RT-PCR用于单个细胞的表达谱分析， Liss, 2002)，自然沉淀的低温组织的组织样本的RIN值略低于cv染色的，etoh固定的，紫外线-LMD对待组织。这种差异可以归因于沉淀混合物的poly-I——在芯片中测量RIN时，一些短链RNA分子被纯化并与其他RNA一起检测，并作为降解比例的一部分计算。在qPCR反应中poly-I不表现出负面影响。因此，固定、染色和紫外线激光显微解剖有或无RNA沉淀的脑切片均不影响RNA质量。图2显示了天然、固定和染色小鼠脑切片的RNA质量比较。
总的来说，研究表明紫外线采用所述方法进行激光显微解剖(Gründemann等，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21761319)不会显著损害冷冻保存脑组织的RNA质量。该技术为样品制备和单细胞非破坏性分离提供了一种合适的方法，以获得质量不变的RNA。
