2015年3月2日故事

通用涂料-动态超分辨率显微镜

活细胞的定位显微镜

超分辨率显微镜技术在过去十年里彻底改变了生物学。在它们的帮助下，细胞成分现在可以以蛋白质的大小被可视化。然而，对于大多数超分辨率原理来说，成像活细胞是一个挑战。在这方面，一种叫做uPAINT(纳米尺度地形成像通用点积累)的技术引起了人们的注意。这种单分子方法利用活细胞中连续标记的、任意膜生物分子的动态成像，揭示超高分辨率的图像和单分子在高密度下的轨迹。

作者

本地化显微镜

基于本地化的超分辨率技术，如风暴，dSTORM/GSDIM或(spt)棕榈都是基于时间去相关荧光通过实现孤立分子的发射，其后续定位与次衍射精度可用于重建超分辨图像。为了使这些方法起作用，在视场内的绝大多数分子必须处于非发射状态。

为了实现荧光发射的时间分离，开发了几种方法:

风暴(随机光学重建显微镜)方法通过借助高功率激光照明将大多数种群置于黑暗状态，实现单分子的时间分辨荧光[1,2,3]．为了使这种方法起作用，标本必须嵌入氧化或还原缓冲液中，以稳定荧光团的关闭状态。随机地，分子的一个亚种群逃离暗态并发出荧光。这个“开率”可以通过样品周围的溶液和第二激光(405 nm)的照明进行微调，这减少了脱态寿命。

棕榈(光激活定位显微镜)技术使用光激活/可转换荧光蛋白，可以“打开”和关闭(4、5)．激活后，它们被成像，直到它们漂白。在这种情况下，激活光源的强度决定了荧光团的激活率。

在定位显微镜技术的帮助下，实现了次衍射分辨率，细胞成分可以以前所未有的细节可视化。然而，这类方法存在一个主要的挑战，即获得活细胞上原生蛋白质的超分辨率图像。

当研究人员需要研究活细胞中高密度的内源性蛋白质时，两者都没有风暴也不棕榈技术完美地满足了所有必要的先决条件。在风暴基于减少成像缓冲的方法与活细胞不兼容。棕榈反过来又取决于对基因修饰嵌合光激活荧光蛋白的利用，因此无法观察到内源性蛋白质。

纳米尺度地形成像的普适点累积(uPAINT)是一种复杂的技术，绕过了这些问题[6]．它的工作原理是在倾斜光照下对细胞表面的单分子轨迹进行动态成像，从而实现对活细胞表面原生生物分子行为的超分辨跟踪。

与传统的定位显微镜方法(利用随机荧光发射成像一小部分分子)相比，uPAINT通过成像低浓度的荧光配体实现了荧光信号的时间分离，因为它们在小光体积内与目标结合并相互作用。

uPAINT原则

Universal PAINT回到最初的方法称为油漆(用于纳米尺度地形成像的点积累)。为此，荧光标记探针在溶液中扩散，并在与感兴趣的物体结合时开始发出荧光。Alexey Sharanov和Robin Hochstrasser介绍了这种方法，用尼罗红连续靶向脂质双分子层和大的单层囊泡，尼罗红在水溶液中不荧光，但在疏水环境中开始荧光[7]．分子在水中的快速扩散导致尼罗河红在膜附近的恒定通量。随后，荧光信号从它进入膜的那一刻就出现了。在这种新的环境中，探针变得荧光，其流动性大大降低，允许相机检测它(几毫秒)，直到照片漂白发生。通过确定每个单个荧光信号的质心，分辨率约为。25纳米是可能的。然而，由于插入时间非常短(毫秒)，不可能在长时间内跟踪单个分子的行为。

后来，Gregory Giannone和Eric Hosy关注并克服了原始PAINT技术的一些局限性。通过使用特异性荧光配体(即抗体)代替非特异性膜染料，单个特异性蛋白相互作用的动态成像成为可能。由于更宽的应用带宽，这种方法被命名为普遍的油漆[6]．

该技术克服了介质中未结合配体的背景荧光倾斜入射(图1)TIRF激光的用途是关键。将略低于临界角的激光发送到玻片上，会形成一个“高倾斜度和层压光学片材(HILO)斜穿过标本。只有在这个体积内的荧光团被激发。

将低浓度的标记配体添加到浸泡样品的介质内的缓冲液中。布朗扩散导致配体在细胞表面连续而随机地与目标分子结合。只有在HILO光束路径内的荧光团被激发并成像(图1)。

图1:uPAINT原理。A)徕卡SR GSD 3D提供了调整激光束穿透角度的机会。用它TIRF(全内反射荧光)可以实现照明，如果激光击中玻片-样品间相超过所谓的临界角度θ

与用于PAINT的脂质探针相对较短且依赖于插入的荧光相比，用于uPAINT的配体信号主要受染料的光漂白而不是配体解离率的限制。

这样就可以用次衍射分辨率跟踪和记录结合配体的运动。随后的数据分析和重建的结果，配体的运动轨迹，指示他们的路线。由于可以收集到大量的数据，可以提取有关配体速度、约束、簇组织等方面的统计数据，例如研究突触上的膜受体(图2)。

无花果。2: uPAINT图像形成的不同步骤。一)转染了突触标记Homer-的神经元的荧光细节绿色荧光蛋白(勾勒出单元格)。B)在实验中获得的单个图像的例子。四个分离良好的单一荧光配体(ATTO 647)结合到其目标结构(未指定)。每个粒子将通过计算(像素大小160纳米)进行超定域。C)所有单粒子定位的过度积累。明亮的像素对应于树突的高度访问区域(像素大小为20 nm)。D)单个蛋白质的轨迹。每一种颜色都对应着单个粒子的运动轨迹。使用JB Sibarita团队(波尔多大学)开发的软件获得了超分辨率图像，该软件作为WaveTracer MetaMorph插件上市。

使用uPAINT可以探索各种生物问题。因此，各自的荧光探针必须根据不同的用途仔细选择。例如到达限制区域，小型探测器等三NTA-atto或Fab片段可以使用(约2纳米[6])．为了记录长轨迹，多偶联抗体是可取的。有趣的是即使是单个分子烦恼实验可以发展[8]．

总之，uPAINT不仅能生成超分辨图像，还能提供活细胞中单个、特异性、膜结合生物分子的超分辨动态信息。与经典的定位显微镜技术相比，uPAINT避免使用有害的缓冲液或转基因蛋白质，因此可以在接近自然的条件下进行观察[9]．

uPAINT技术的一个局限性是它局限于研究质膜结合分子。由于荧光标记的抗体不能穿透活细胞的完整质膜，因此不可能使用uPAINT来研究细胞内蛋白质动态。

uPAINT与徕卡SR GSD 3D

徕卡SR GSD 3D提供两种基本的操作模式:Epifluorescence和TIRF照明。为TIRF(全内反射荧光)照明TIRF照射器将激光束对准包含样品在水溶液中的盖玻璃。如果激光束超过玻璃滑梯-水界面的临界角度，就会发生全反射。与此同时，一种倏逝波传播到玻片另一侧的标本中。它的穿透深度可以通过倾斜激光角度从80到250纳米操纵。只有在倏逝场中的荧光团才会被激发，从而产生非常好的信噪比。因为这个原因TIRF照明是观察等离子膜附近过程的首选技术(图1)。

通过改变激光入射角低于临界角，它通过玻片，随后斜照射样品。意味着只有一小部分样品被激发光照亮。在这种所谓的HILO(高倾斜层压光学片)模式下获得的图像显示出低背景和良好的信噪比。此外，这种方法可以减少漂白和光毒性，从而延长细胞活力(图1)。

在实践中，徕卡SR GSD 3D提供了两种不同的工作模式来操作激光束TIRF分别为HILO照明(见图3)。

的自动模式允许选择预定义的渗透深度逐步在80和250纳米之间。此外，可通过四种不同的方法确定倏逝场的方向(方位角)。

的专家模式允许通过移动绿色区域内的滑块自由选择倏消场的穿透深度(见图3)。超过绿色区域，激光超过临界角，开始诱导HILO斜照度。

图3:自动模式与专家模式:激发激光束的穿透深度和方位角可由成像软件控制。A)自动模式可以在80 ~ 250 nm之间逐步选择倏逝场的穿透深度，加上四个不同的倏逝场方向。B)专家模式允许通过滑块设置无级穿透深度。绿色区域标志着TIRF区。C)将滑块移出果岭TIRF区域实现HILO照明。

在uPAINT实验中，生长在玻璃底室中的细胞应该被非荧光介质(离子溶液，如Tyrode’s介质)覆盖，并放置在显微镜上。在亮场模式下搜索细胞后，可以识别并聚焦一个有趣的区域进行观察。随后，显微镜必须切换到GSD模式，必须选择正确的滤镜立方体和激光器。现在专家模式有助于找到HILO照明的正确设置(见上文)。请注意，滑块的位置和反过来激光的穿透角度取决于电池的厚度。然后将荧光团偶联抗体或配体添加到培养基中。在随后的采集过程中，只有与质膜上相关抗原结合的荧光团才会发出荧光。由于斜光照射，未结合的配体不会被激发，防止了它们的漂白，降低了噪声水平。在实验过程中，可以对质膜蛋白的不断标记进行成像。原始数据文件随后可用于重建超分辨率单分子的定位和动力学。

uPAINT实验有时需要很长的获取周期(几十秒)来揭示几乎所有感兴趣的蛋白质的运动和组织。在这些情况下，漂移可以通过图像对图像检测珠的位置来纠正(例如TetraSpeck)^TM)．采集后，徕卡SR GSD 3D软件能够通过珠子的定位自动重新定位每个图像。例如，在研究纳米级簇时，这种漂移校正模式是必不可少的。

总之，徕卡SR GSD 3D提供了不同的照明选择。它最初的用途是做dSTORM/GSDIM超分辨率显微镜TIRF或偶发荧光照明。此外，还可以进行HILO照明，这是uPAINT所必需的。因此，静态和动态的蛋白质数据可以通过一台显微镜进行超分辨率的组织检查，以及活细胞内内源性水平的蛋白质动态。