荧光活细胞成像技术

保持样品在生理条件下:

在样品制备和成像过程中，要考虑的最重要的事情是保持样品的活性和健康。因此，将样品维持在尽可能接近生理条件的环境中是至关重要的，即温度、pH值、氧水平和其他重要因素。

最小光照压力:

将活细胞暴露在光线下导致光毒性和样本生理学的变化，因此您可能会得到不像健康生物体中实际发生的结果的结果。为了尽可能地避免光毒性，宽场显微镜通常是成像活标本的首选技术。它们用低剂量的LED光照射样品来激发荧光团，图像采集比其他显微镜方法更快，例如共聚焦成像。

样品标签:

当对活体标本成像时，荧光蛋白通常是选择的工具，用来标记你想要研究的事件发生的标本结构，因为与其他标签相比，这些蛋白质通常毒性更小，并避免了抗体无法进入细胞的问题。荧光蛋白技术依赖于基因编码的荧光团，可用于跟踪活细胞中的标记生物分子及其相互作用等。同时使用多个荧光蛋白，称为多色或多路成像，允许您同步观察多个细胞结构和过程，提供更多的生理相关结果，从而为测量增加背景。为了了解更多关于如何在活样本中进行多色成像的信息，读这篇文章．

应用于活细胞成像的显微技术范围很广。通常，细胞的生长、细胞聚集或细胞运动是通过使用复合显微镜和相位反差和差分干涉反差等方法来观察的(迪拜国际资本)．较大的标本，如正在发育的斑马鱼胚胎，通常用立体显微镜或宏观显微镜进行延时成像。

这篇文章的重点是荧光显微镜技术，在过去的几十年里已经变得更加突出。这篇简短的概述包括常用的定量方法，以及宽视野显微镜常用的photomanpc技术。

由于细胞胞质中离子的组成决定了许多重要的功能，如神经元的兴奋性、基因转录和细胞运动等，细胞内离子的时空调控是生命科学研究的重要内容。离子成像(钙、氯、镁)是一种常用的方法，它使用荧光染料或特别设计的蛋白质来改变钙结合后的发射行为。这使得研究人员可以观察细胞中离子浓度的动态变化。此外，用特殊的荧光染料也可以成像细胞内的ph值或电压。比率成像是一种检测离子水平、pH水平或电压变化的特殊技术。这是一组可以精确测定细胞变化的方法，例如，细胞内钙浓度，而不是像非比率法那样监测相对变化。

全内部反射荧光或TIRF是一种特殊的技术，用来观察位于细胞质膜或细胞质膜附近的事件。通过使用只穿透60-250 nm的荧光激发场，TIRF显微镜具有无与伦比的z分辨率，能够成像发生在浆膜内或浆膜附近的事件，例如分子向浆膜的运输。TIRF避免被细胞内部分子发出的荧光信号淹没的问题。

TIRF图像:半乳糖凝集素-3囊泡沿肌动蛋白丝靠近细胞膜的运输。

Förster共振能量转移或烦恼属于一组人造操作技术，它能使你通过光线与标本中观察到的事件进行交互。

烦恼是定量分子动力学的有用工具，如蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质- dna相互作用，蛋白质构象变化。烦恼成像通常使用的是导数绿色荧光蛋白(绿色荧光蛋白)，特别是CFP和YFP(分别为青色和黄色荧光蛋白)，它们都是利用分子生物学方法附着在感兴趣的蛋白上。然后用荧光灯激发CFP分子。一旦感兴趣的蛋白质在空间上接近(<20 nm)， CFP将作为供体，并将以光的形式发射的能量转移到作为受体的YFP。研究人员将观察CFP发出的蓝色荧光向YFP发出的黄色荧光的转变。在BRET(生物发光共振能量转移)的情况下，供体是作为供体的生物发光分子(例如荧光素酶衍生物)，就像在烦恼,一个绿色荧光蛋白衍生物充当受体。

光漂白后的荧光恢复(收紧)是另一种操作技术，常用于监控蛋白质或囊泡的传输。收紧使用荧光蛋白(通常绿色荧光蛋白)附着在感兴趣的蛋白质上，也就是一种需要监测其运动的蛋白质。通常，整个细胞最初都是荧光的，因为蛋白质可能在整个细胞中都很丰富。然后，细胞的某个特定区域(通常具有神经元细胞中的轴突或树突等细胞结构)暴露在高强度的光下，以消除(漂白)该特定区域的荧光。随着感兴趣的蛋白质移动，它将以一定的速度出现在漂白区域，这可以通过从该区域恢复的荧光信号来追踪，让研究人员了解细胞内运输动力学。

光活化是最近发展起来的一种方法，通过使用特别设计的染料，如光活化绿色荧光蛋白(paGFP)或Kaede，选择性地标记细胞或生物体中感兴趣的区域。这些染料只有在用特定波长的光照射后才显示出显著的荧光。这些染料也可以融合到一个感兴趣的蛋白质，以研究其表达或运输动力学使用收紧或粒子跟踪。