简介
极性上皮细胞可以在多细胞生物的表面发现，并可以覆盖全身的空腔，以这种方式作为保护屏障。因此，它们调节不同物质的分泌和交换。在极化上皮细胞的发育和维持中最重要的问题之一是顶端和基底外侧质膜的特定组成。因此，蛋白质和脂质被分离成不同的囊泡群，注定位于两个膜域中的一个。囊泡运输的基本过程涉及由肌动蛋白微丝和微管形成的细胞骨架轨道的完整性。特别是微管是长距离运输过程所必需的，因此，上皮细胞薄片的完整性可能因微管组成的改变而受到干扰(Yap et al.， 1995)。早期描述的翻译后修饰之一是微管蛋白的酪氨酸-脱氨酸循环，其中从α-微管蛋白的c端添加酪氨酸残基(酪氨酸化)或去除酪氨酸残基(脱氨酸化)。动态微管被认为是酪氨酸化(tyr-)，而去酪氨酸化(detyr-)形式可以在稳定微管中发现，抑制微管分解(Peris et al.， 2009)。在这篇文章中，我们展示了通过过度表达或敲低其中一种负责酶，微管蛋白酪氨酸连接酶(TTL，它将酪氨酸残基添加到微管蛋白中)来干预这种平衡，改变了tyr-和detyr-微管之间的平衡，这导致上皮单层形成的破坏，并影响顶端蛋白质的运输。
去酪氨酸和酪氨酸微管蛋白在极化上皮细胞中的分布及极化过程中的波动
为了分析极化细胞的根尖和基底外侧转运过程，有必要使用免疫荧光显微镜检查不同微管蛋白修饰的排列。在MDCK细胞囊肿(在Matrigel中培养)中，去酪氨酸化和酪氨酸化微管沿顶端-基底外侧轴均匀分布(图1A)。detyr-或tir -微管蛋白都不优先集中在两个细胞极点之一。然后通过MDCK细胞的高分辨率GSD显微镜(Leica SR GSD Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)分析detyr-和tir -tubulin在单个微管上的分布。188金宝搏的网址由于该技术需要相对平坦的物体才能获得最佳结果，因此MDCK野生型细胞仅在覆盖物上生长了一天。用冰甲醇固定5分钟后，用1%奶粉在PBS++ (PBS加1mm氯化钙)中封闭细胞1小时2和1mm MgCl2)．用抗α微管蛋白、抗detyr微管蛋白或抗tir微管蛋白一抗免疫染色2小时，再用Alexa488或alexa647偶联二抗标记1小时。盖片在PBS中10 mM MEA (β-巯基乙胺)中用Twinsil密封在显微镜载玻片的腔体上®以1:1的比例。如图1B所示，α微管蛋白抗体沿微管均匀分布。如果使用针对tyr-或deyr -微管蛋白的特异性抗体，长度达1 μ m的deyr -微管蛋白短段会被更长的tir -微管蛋白段破坏，后者也集中在微管末端。所以detyr-和tyr-微管蛋白就像珍珠线一样沿着微管排列。类似的基于电子显微镜的观察以前已经描述过(Geuens et al.， 1986)。
图1:(一个)用共聚焦显微镜观察在Matrigel中培养7 d的MDCK细胞囊肿。免疫染色使用针对脱酪氨酸(AlexaFluor488)和酪氨酸微管蛋白(AlexaFluor546)的抗体。比例尺，20µm。（B)用AlexaFluor488和AlexaFluor647对播种后1天的细胞进行免疫染色，标记detyr-、tyr-或alpha-tubulin。比例尺，5微米，放大切片，1微米。（C) MDCK和MDCKTTL -绿色荧光蛋白在播种3天后，用特异性deyr -tubulin抗体(AlexaFluor546)对细胞(绿色)进行免疫染色。比例尺，20µm (D) MDCK和MDCKTTL -绿色荧光蛋白将细胞以相同密度播种在盖玻片上，孵育一天后固定，用抗微管蛋白抗体(Alexa546)进行免疫染色。比例尺，20µm。细胞核用蓝色表示。
微管蛋白酪氨酸连接酶对脱特尔微管蛋白的损耗
为了证实tyr-和deyr -微管蛋白在极化过程中变化的影响，我们通过在MDCK细胞中稳定过表达微管蛋白酪氨酸连接酶来破坏微管蛋白的翻译后修饰。这些MDCKTTL -绿色荧光蛋白细胞detyr-tubulin显著减少(图1C)。dethyr -tubulin缺失MDCK菌株(MDCKTTL -绿色荧光蛋白)，然后分析细胞形态的改变。MDCK电镀后一天TTL -绿色荧光蛋白细胞显示出连接成岛的趋势(图1D)和过早极化。进一步的研究也表明TTL的表达可以调节MDCK细胞中根尖蛋白的表面传递(Zink et al.， in press)。
结论
在本研究中，我们分析了翻译后微管蛋白修饰在极化上皮细胞生成和维持中的作用。通过超分辨率GSD显微镜更详细地研究了detyr-和tir -微管蛋白的分布，因此我们能够确认以前基于电子显微镜和荧光显微镜技术的观察结果。
