黑暗面的力量- GSDIM超分辨率定位显微镜的嵌入介质

克服~200 nm衍射极限的关键在于GSDIM显微镜是连续关闭和关闭荧光团，因此他们的时间分离。在这种情况下，荧光团的电子通过应用高功率激光束积累在亚稳态，非荧光暗态(三态和其他)[２]．从暗态，分子随机返回到基态，进入荧光循环，被显微镜检测-所谓的“闪烁”。随着时间的推移，这些荧光事件被捕获。为获得高分辨率图像，采用拟合算法读出衍射限制事件。最终，通过绘制数千个记录事件的测量位置来重建最终的高分辨率图像(图1)。

与GSDIM横向分辨率可达20nm[２]．在实践中，最终分辨率取决于单个荧光团的定位精度，而定位精度又由荧光团和包埋介质的性质决定。下面的方程[3]表明定位精度取决于单个荧光团发射的收集光子的数量:

Δr表示显微镜/物镜的衍射极限，n表示单个局部荧光团发射的光子数和Δr_短信不同荧光团的定位精度。

最终，实现最佳定位精度的目标与以下工作直接相关:a)最大限度地提高每个荧光团/事件发射的光子数量;b)最大限度地提高荧光循环数量(=最大限度地减少光漂白)。这些特性基本上是由荧光团的性质和周围的嵌入介质的相互作用影响的暗状态，从而影响闪烁性能。

在3D中GSDIM系统将一个圆柱形透镜引入显微镜的光路中。由此产生的光学散光导致那些不在焦平面[4]的闪烁事件呈椭圆度。焦点平面以上事件的点扩散函数(PSF)在垂直方向上被拉长，而焦点平面以下事件的点扩散函数在水平方向上被拉长。该软件最后将每个闪烁事件与一个不同的z坐标相关联。很明显，这种方法需要对每个闪烁事件进行良好校准和高定位精度。因此，通过优化的嵌入方法可以获得令人印象深刻的三维数据(图2)。

图2:3DGSDIM微管和线粒体的高分辨率图像
COS-7细胞的微管(A)和MDCK细胞的线粒体(B)，假色编码，z-位置0-800 nm。用AlexaFluor对细胞进行α微管蛋白或ATP5B染色^®647，并嵌入vectasshield^®/ Glycerol-TRIS。为了进行比较，宽视场图像被描绘在各自的3D超分辨率图像之上。比例尺10µm。

最重要的一步GSDIM显微镜是使几乎所有的荧光团进入长寿命的黑暗状态，这是依赖于特殊的嵌入介质。目前已知的一些介质，如葡萄糖氧化酶混合物或聚乙烯醇(PVA)，往往会减少样本中分子氧的数量。氧作为三态猝灭剂，从而减少了三态荧光团的数量。这绝对会适得其反GSDIM因为三重态是通往黑暗态的重要途径。因此，由于更多的荧光团处于“开”状态，干扰了超分辨率图像采集过程，因此三态荧光团种群的减少间接导致了定位精度和最终分辨率的损失。

与其他高分辨率技术相比，GSDIM显微镜是使用标准荧光团和常规染色方案，这是在常见的光学显微镜方法。仅结合荧光团和包埋介质存在局限性。然而，目前使用GSDIM介质已经允许应用非常广泛的不同荧光团，甚至荧光蛋白。然而，它们都有各自的优点和缺点(图3)。例如，最常用的介质半胱胺或β-巯基乙醇胺(MEA)适用于各种荧光基团，但不幸的是，介质必须使用新鲜的，其效率在使用6小时后显著下降，导致闪烁性能下降。因此，寻找其他嵌入介质和合适的荧光团是充分挖掘这种超分辨率显微镜方法巨大潜力的重要一步。

Vectashield^®- 3D GSDIM显微镜的替代嵌入介质

在这个背景下，Olivier等人。能识别出安装介质vectasshield^®(Vectorlabs™)作为合适的嵌入介质dSTORM显微镜[1]．在这里我们测试了这种新的嵌入方法是否可以用于3DGSDIM与目前使用的介质相比，显微镜和搜索的优点。此外，我们还对与vectasshield联合使用的其他荧光团进行了系统筛选^®．

值得注意的是，我们发现荧光团对AlexaFluor^®647和AlexaFluor^®555 (Life Technologies™)在这种嵌入介质中表现出出色的性能，具有出色的闪烁性能，可在3D中实现最高的定位精度GSDIM．这与Olivier等人的发现一致。[1]．与AlexaFluor^®647和AlexaFluor^®我们能够生成令人印象深刻的3DGSDIM结合vectasshield . data(图5)^®, AlexaFluor^®647和AlexaFluor^®与目前使用的荧光团配对如AlexaFluor相比，555甚至表现出优越的闪烁性能^®647和AlexaFluor^®488的MEA或葡萄糖氧化酶混合物。这可以通过比较使用vectasshield执行的事件列表的两个闪烁图像来可视化^®或MEA(图4)，并强调了这种嵌入介质的巨大潜力。

事实上，荧光染料对的闪烁特性并不是这种介质的唯一巨大优势:用Vectashield®/Glycerol-TRIS处理的样品可以在4°C下保存数月而不会失去其优异的闪烁特性(图6)。

缺点，如相对较强的自发荧光和产生的背景，特别是在532 nm激光范围内，可以通过混合Vectashield来减少^®用含有甘油和50 mM TRIS pH值8的缓冲液，比例为1:10[1]．所谓的405nm波长的回抽激光器，用于增加荧光团的荧光循环次数，通常不需要AlexaFluor^®647或AlexaFluor^®555，因为他们出色的闪烁特性在vectasshield^®．这也可以防止背景的形成。

在我们进一步确定其他合适荧光团的研究中，有趣的是，我们发现荧光蛋白EYFP具有可接受的闪烁性能，与葡萄糖-氧化酶混合物中的性能相当。

不幸的是，我们无法找到其他荧光团，特别是在488 nm范围内，AlexaFluor®488和Atto^®488没有显示出预期的闪烁性能。关于大量尚未测试的候选荧光团和为超分辨率显微镜专门设计的荧光团的数量不断增加，有限数量的荧光团的缺点在未来肯定会减少。在MEA的情况下，闪烁荧光团与Vectashield组合的列表^®肯定会随着时间的推移和不断的测试而增长。

表1:验证的荧光团(也比较Olivier等。[1]）.所列荧光团通过免疫染色ATP5B和α微管蛋白检测嵌入vectasshield的COS-7细胞^®/ Glycerol-TRIS(1:10)。用徕卡SR GSD 3D系统评估他们的眨眼行为。

图5:3DGSDIM高分辨率图像-线粒体和微管的双重染色。用AlexaFluor染色COS-7细胞对抗α微管蛋白和ATP5B^®647和AlexaFluor^®分别为555。标本被埋入vectasshield^®/ Glycerol-TRIS。的比较GSDIM和反卷积的宽视场3D堆栈。微管(α微管蛋白)为绿色，线粒体(ATP5B)为红色。

图6:3D高分辨率图像对比:新鲜标本(A)与两个月标本(B)。(一)3 dGSDIM微管图像为绿色，线粒体图像为红色或伪彩色代码，分别表示z-位置。如图5所示，标本嵌入vectasshield /Glycerol-TRIS中。(B)图5和图6A中使用的标本在4°C下保存两个月，然后再次成像，仍然嵌入vectasshield中^®/ Glycerol-TRIS。

COS-7细胞在精密盖玻片(Marienfeld-Superior™)上培养一天，然后用冰冷的甲醇固定。在含1%奶粉的PBS中阻断1小时后，细胞与针对ATP5B (Santa Cruz™)和α-微管蛋白(Sigma™)的一抗以1:100的比例在PBS/奶粉中孵育2小时。用AlexaFluor标记一抗^®647或AlexaFluor^®555，二抗以1:200的稀释量在PBS中孵育1 h。除奶粉块外，每一步都伴随着四步PBS清洗。

如图7所示，单元格被嵌入到vectasshield中^®/ Glycerol-TRIS-buffer (Vectashield^®甘油- tris缓冲液1:10;甘油与50 mM TRIS pH值8):75-100 μ L的介质放置在凹陷载玻片的腔体上。然后盖玻片放置在凹陷载玻片上，细胞面向培养基和凹陷。在这一步，重要的是要避免任何气泡。多余的介质必须用滤纸去除，以确保双组份硅酮孪生^®能够正确干燥。Twinsil的黄色和蓝色组件^®1:1混合，然后应用于封面的边缘。10分钟后，硅树脂硬化，标本准备GSDIM成像。

通过区域或时间分离单个荧光事件来打破衍射障碍已经彻底改变了光学显微镜。在未来，由于衍射极限，将不再有更多的分辨率限制，但分辨率限制不断降低的显微镜的发展揭示了新的挑战，如在的情况下标记或嵌入介质GSDIM显微镜。如前所述，所有超分辨率方法的关键步骤都是获得暗面荧光团，这是良好定位精度的基础。在GSDIM在显微镜下，这一过程主要受嵌入介质的存在影响。在这里，嵌入介质和荧光团性质之间的相互作用是成功的高分辨率成像的决定性因素。

现在，我们有强大的荧光团配对，如AlexaFluor^®647和AlexaFluor^®488在MEA或AlexaFluor^®647和AlexaFluor^®555在vectasshield^®/甘油- tris，可以获得令人印象深刻的3D超分辨率图像在两种颜色。在不久的将来，我们的高效荧光团与嵌入介质vectasshield相结合^®通过不断的测试和实践经验肯定会得到扩展。与其他高分辨率技术一起发生的显微镜，这将给我们一个全新的视角来看待细胞生命及其生化调控。

1. Olivier N, Keller D, Gönczy P和Manley S: 3D STORM显微镜的简单缓冲。生物医学。Opt. Express 4(6): 885-99(2013)。
2. Fölling J, Bossi M, Bock H, Medda R, Wurm CA, Hein B, Jakobs, Eggeling C和Hell SW:荧光纳米通过基态损耗和单分子返回。自然学报，5:943-45(2008)。
3. Thompson RE, Larson DR和Webb WW:单个荧光探针的精确纳米定位分析。生物物理学报82:2775-83(2002)。
4. 黄斌，王伟，贝茨M，庄欣:随机光学重建显微镜的三维超分辨率成像。科学319:810-13(2008)。