Cryo-CLEM之旅

Cryo CLEM到底是什么,为什么它能帮助科学家获得更深入的了解

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这篇文章描述了低温CLEM技术及其能为科学家提供的好处。此外,还突出了一些科学出版物。

Cryo电子显微镜工作流程的最新进程使得能够以低于1nm的前所未有的分辨率获得细胞蛋白质社会学的3D数据。工作流程中的一个步骤,从样本到纳米级分辨率,可能需要获得这种结果需要冷冻光学显微镜。当在低温电子 - 显微镜工作流中使用这种显微镜时,它通常称为CryoCLEM

为了提高生成所需数据的工作流程的可靠性,无论是对于低温电子显微镜,还是对于低温层析成像,低温光学显微镜都是检查样品质量和识别靶点的必要工具。在这里,我们总结了目前可用的低温CLEM解决方案,包括使用的技术的一些背景、典型的工作流步骤和已发表的科学成果。

来自Leica Microsy188金宝搏的网址stems的Cryo Clem

徕卡微系统公司(Leica Microsystems)的格言“从眼睛到188金宝搏的网址洞察力”(From Eye to Insight)说得很对:作为人类,我们主要是由我们的视觉系统驱动的。我们很容易相信我们所看到的。一图胜千言。为了从生活或更好的科学样本中获得图像,当样本或其有趣的内容离开厘米范围时,显微镜是最好的选择。因此,它实在是太小了,肉眼无法看到。

显微镜技术

存在不同类型的显微镜,这有助于特定维度范围的特定样本。光学显微镜范围从立体显微镜,宏观,荧光显微镜,共聚焦显微镜具有许多技巧来增加分辨率,对比等,所有这些光学显微镜在倍率时都有它们的限制。在该边界电子显微镜步骤中,允许看到甚至更小的结构,这些结构被限制为光学显微镜。过去的世界,光线和电子显微镜的极限已被推动到新的限制,并将在将来进一步推动。

样品制备

除显微镜技术外,样品制备对可视化也起着至关重要的作用。科学家们希望看到他们的样本的自然状态,或者至少尽可能接近。化学固定技术可以改变自然状态。到目前为止,活细胞还仅限于光镜下的研究。保存天然状态的电子显微镜可以实现完全玻璃化样品。

CLEM解决方案

在徕卡188金宝搏的网址微系统公司,我们不断改进光学显微镜和电子显微镜的结合。这个过程通常被称为CLEM(相关光学和电子显微镜)。除了已建立的工具em.样品准备如网格柱塞徕卡em.GP2,高压冰箱徕卡em.冰,真空转移系统徕卡em.vct和新的纳米工作流结合了徕卡雷霆成像仪直播细胞和徕卡em.ICE通过玻璃化在特定时间点保存样本,徕卡THUNDER成像仪em.Cryoclem是钥匙工具CLEM在低温条件下的方法。

合力em.样品制备知识和科学显微镜专业知识使徕卡微系统从一个单一的供应商提供这种解决方案。188金宝搏的网址徕卡CryoCLEM解决方案自推出以来,使许多高影响力的出版物成为可能:

Strnad et al., Sci rep 2015 Dec 10;5:18029。doi: 10.1038 / srep18029[1]

Schorb et al., J Struct Biol. 2017 Feb;197(2):83-93。doi: 10.1016 / j.jsb.2016.06.020[2]

Kolovou et al., Methods Cell Biol. 2017;140:85-103。doi: 10.1016 / bs.mcb.2017.03.011[3]

acta botanica yunnanica(云南植物研究中心),2017;doi: 10.1016 / bs.mcb.2017.03.012[4]

杨等人。,j struct biol。2021 2月18日; 213(2):107709。DOI:10.1016 / J.JSB.2021.107709[5]

Leica Cryo的关键CLEM解决方案是在低温条件下能够安全转移样品的转移梭。

THUNDER Imager EM Cryo CLEM - Media | Products | 188金宝搏的网址Leica Microsystems(徕卡microsystems.com)

独特的梭式传送设计使我们能够将样品传送系统和显微镜台分开。这将减少交叉污染。节省的时间是一个额外的效果,因为梭可以在荧光成像期间顺利干燥,或简单地第二个梭可以准备样品转移,而成像发生。

荧光成像的分离撒小谎铣削有许多优点。例如,荧光成像可以在样品进入低温前进行快速质量检查撒小谎-扫描电镜或低温TEM.这将最大限度地利用撒小谎-扫描电镜TEM作为样品适用性的系统时间被给出和预先校对。在样本进入的情况下em.可以确定目标的荧光表达,检查网格损伤等。像大多数em.系统可在设施,光学显微镜证明高质量的样品允许最大限度的结果在预订的会议。

解决方案的发展

基于宽场荧光显微镜与特殊的Cryo阶段的初始组合,以允许样品在冻结冻结后保持在低温/玻璃化条件下,已经进行了许多解决方案方法。与Leica的计算清算方法雷或甚至包括闪电在内的共聚焦显微镜的组合是可商购的。此外,科学家还与超分辨率技术的结合工作:Wolff等人。,Biol细胞。2016年9月108(9):245-58。DOI:10.1111 / BOC.201600008[6].冷冻撒小谎Lift out也在进一步发展的路线图上:Klumpe等人,bioRxiv预印doi: https://doi.org/10.1101/2021.05.19.444745[7]

实际应用

随着技术开发的兴奋和推动方法的限制,CryoCLEM方法导致了科学见解。结构生物学显然是低温最重要的领域CLEM

Paul et al., J Cell Biol. 2020 9月7日;219(9):e201911154[8]在细胞骨架形式中发现了意想不到的多功能性,更具体地说,他们通过对这些小分子诱导投影的原位低温电子断层扫描(cryo-ET)分析,在微管腔内发现了丝状肌动蛋白(F-actin)。因此,低温荧光显微镜有助于识别有突出物出现的细胞。

Allegretti等人。,性质。2020年10月; 586(7831):796-800[9]能够直接识别核孔隙络合物(NPC)在其细胞背景下对大分子水平的结构功能关系。冷冻CLEM调查有助于鉴定氮饥饿水平,因此对NPC进行自噬机械招募的时间点。

李等人。,Prog Biophymy mol Biol。2021 Mar; 160:87-96[10]使用冷冻荧光显微镜鉴定和标记线粒体的PC12细胞的过度神经胶质。荧光标记用于易于导航的以下Cryo Electrocography(Cryo Et)。

Klein et al., Commun Biol. 2021年1月29日;4(1):137[11]研究了层状体(LBs),发现一种未被描述的外膜圆顶蛋白复合物(OMDP)是层状体的限制膜。他们的数据是通过标记LBs的荧光显微镜与撒小谎低温荧光显微镜表明,LB的生物发生是由平行膜片进口和极限膜曲率驱动的,以最大限度地提高脂质储存能力。

一般来说,低温CLEM是一种有效的工作流程方法来研究宿主病原体相互作用,特别是由于病毒的大小而尤其是病毒感染。此类方法的例子是:

Strnad et al., Sci rep 2015 Dec 10;5:18029。doi: 10.1038 / srep18029[1]

Hampton等人。,Nat Protoc。2017年1月12日(1):150-167[12]

Vancová et al., Front Microbiol. 2017 Apr 11;8:596[13]

外表

作为Cryo.CLEM是一项相当年轻的技术,在过去的一年里发展成为一种工具,不再局限于专家,它将是未来科学工作流程的关键一步,以发现未知的东西。Dr. Julia König,徕卡雷电成像仪的产品经理em.冷冻CLEM总结:

到目前为止,我们已经揭开了细胞内部的秘密;我们会在整个组织中发现什么?

参考文献

  1. Strnad M,ElsterováJ,SchrenkováJ,Vancovám,rego Ro,Grubhoffer L,Nebesářová,相关冷冻荧光和低温扫描电子显微镜作为研究Host-pathogen Interactions的直接工具,J.Sci Rep. 2015 2015年12月10日;5:18029。DOI:10.1038 / srep18029。
  2. Schorb M, Gaechter L, Avinoam O, Sieckmann F, Clarke M, Bebeacua C, Bykov YS, Sonnen AF, Lihl R, Briggs JAG,半自动化相关低温荧光和低温电子显微镜/层析成像的新硬件和工作流程,J Struct Biol. 2017 Feb;197(2):83-93。doi: 10.1016 / j.jsb.2016.06.020。2016年6月28日。
  3. 一种基于相关工作流程的细胞单层冷冻切片新方法,中国生物医学工程学报,2017;doi: 10.1016 / bs.mcb.2017.03.011。2017年4月13日。
  4. Schorb M,Sieckmann F,Matrix Maps-一种直观的软件,用于获取,分析和注释光学克隆的光学显微镜数据,方法细胞BIOL。2017; 140:321-333。DOI:10.1016 / bs.mcb.2017.03.012。EPUB 2017年4月19日。
  5. Yang JE, Larson MR, Sibert BS, Shrum S, Wright ER, CorRelator:一种实时高精密低温相关光电子显微镜的交互软件,J Struct Biol. 2021年2月18日;doi: 10.1016 / j.jsb.2021.107709。在印刷之前在线。
  6. 张晓东,张晓东,张晓东,张晓东。超分辨率荧光显微技术的研究进展[j] .中国生物医学工程学报,2016;doi: 10.1111 / boc.201600008。2016年6月22日。
  7. Klumpe S, Fung HKH, Goetz SK, Zagoriy I, Hampoelz B, Zhang X, Erdmann PS, Baumbach J, Müller CW, Beck M, Plitzko JM, Mahamid J,模块化平台流线自动化冷冻纤维工作流,bioRxiv预印doi: https://doi.org/10.1101/2021.05.19.444745
  8. 原位冷冻电子断层扫描显示微管腔内丝状肌动蛋白,J Cell Biol. 2020 9月7日;219(9):e201911154。doi: 10.1083 / jcb.201911154。
  9. Allegretti M,Zimmerli Ce,Rantos V,Wilfling F,Ronchi P,Fung HKH,Lee CW,Hagen W,Turońováb,Karius K,BörmelM,Zhang X,MüllerCW,Schwab Y,Mahamid J,Pfander B,Kosinski J,Beck M,核孔的细胞架构和营业额的快照,性质。2020年10月; 586(7831):796-800。DOI:10.1038 / S41586-020-2670-5。EPUB 2020 SEP 2。
  10. Li X, Park D, Chang Y, Radhakrishnan A, Wu H, Wang P, Liu J, A system of high-resolution imaging of the哺乳动物完整细胞,Prog biophysics Mol Biol. 2021年3月;160:87-96。doi: 10.1016 / j.pbiomolbio.2020.09.005。10月13日
  11. Klein S, Wimmer BH, Winter SL, Kolovou A, Laketa V, Chlanda P, Post-correlation on lamellar cryo-CLEM揭示板层体的膜结构,Commun Biol. 2021年1月29日;4(1):137。doi: 10.1038 / s42003 - 020 - 01567 - z。
  12. 相关荧光显微镜和低温电子断层成像技术在病毒感染或转染的哺乳动物细胞中的应用,国家自然科学基金2017年1月;12(1):150-167doi: 10.1038 / nprot.2016.168。12月15日。
  13. 链接本文:Vancová M, Rudenko N, Vaněček J, Golovchenko M, Strnad M, Rego ROM, Tichá L, Grubhoffer L, Nebesářová J,莱姆病病原菌伯氏疏螺旋体在生理胁迫条件下的多形性和活力:低温荧光和低温扫描电镜研究,Front microbibi2017 Apr 11;8:596。doi: 10.3389 / fmicb.2017.00596。eCollection 2017。

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