TauSense相互作用-研究分子相互作用

荧光显微镜是生命科学的支柱之一，是一种常用来揭示细胞结构和功能的工具。荧光显微镜的一个关键优势在于能够识别多个目标，并解决它们如何与分子特异性和空间背景作用。从机械的角度来看，这一信息是相关的，因为所有的细胞过程都是通过生物分子接近和传统描述的相互作用来运作的。

分子间的相互作用为细胞机制提供动力，将基因组信息转化为物理工作(Jacob F, Monod J. 1961)。广义上讲，分子相互作用至少有三种类型:核酸(DNA/RNA)-蛋白质、蛋白质-蛋白质和小分子-蛋白质(Zhang W et al. 2002, Schlessinger K et al. 2009, Yan L and Lamb RF 2011, Dunn JA et al. 2015, Pires BRB et al. 2018, Vidya MK et al. 2018)。

选择的工具，以实验确认两个分子之间的相互作用是通过Förster共振能量转移(烦恼， Förster 1960)。执行烦恼实验中，其中一个被研究的分子被标记为荧光探针作为“供体”，另一个被标记为探针作为“受体”。这种所谓的“供体-受体对”是选择性选择的，因此供体的发射基本上与受体的吸收重叠。在这些条件下，烦恼如果两个荧光团彼此足够接近(小于10纳米- Valeur 2001)，并且它们是有利取向的(Pietraszewska-Bogiel和Gadella 2011)，则可以发生。距离和方向将决定多少烦恼正在发生;这被称为烦恼效率和最广泛的量化分子相互作用的方法(Valeur 2001)。的发生时报告的另一个值烦恼是相互作用供体(fD)的比例，对应于在给定时间有多少分子参与分子相互作用(Valeur 2001)。本质上，能量从供体荧光团的激发态转移非辐射(不发射光子)通过吸收到受体荧光团。这一过程导致1)供体荧光强度降低，2)受体荧光强度增加，3)供体荧光寿命降低(Jares-Erijman and Jovin 2006)。这些来自供体和受体的不同读数是获取和分析若干策略的基础烦恼数据。许多烦恼方法依赖于基于强度的测量，如供体猝灭、受体光漂白和敏化发射(Berney和Danuser 2003年，Padilla-Parra和Tramier 2012年，Algar WR等人2019年)。灰度烦恼简化了仪器要求，但增加了实验设计的伪影风险(例如，不平衡的供体-受体相对信号，内部过滤器效应，供体光漂白，光致色性)或与动态活标本见解不兼容(例如，样品光毒性)。

荧光寿命成像显微镜(这部电影) - - -烦恼仍然是黄金标准方法，因为烦恼读数仅依赖于供体荧光寿命的变化，因此绕过了大多数基于强度的方法所提到的注意事项(Padilla-Parra和Tramier 2012;Algar WR等，2019)。然而，历史的复杂性这部电影对专注于生物物理的特殊群体采用有限的基于寿命的方法。

在基于寿命的方法中，人们一直在努力寻找更直接的方法来利用烦恼不需要复杂的物理模型。这些非拟合方法主要侧重于提供相关数据，以更好地理解所研究的生物系统(Leray et al 2013)。供体分子的最小比例(曼氏金融_D)是一个简单而强大的概念，遵循这一哲学(Padilla-Parra S et al. 2008, 2011和Leray et al. 2013)。的目的曼氏金融_D是评估所涉及的分子的最小数目烦恼．曼氏金融_D与相互作用供体的比例有关(f_D， Padilla-Parra S et al. 2008)。为此，曼氏金融_D在没有受体的情况下使用来自供体分子的荧光寿命值(图1a)。由此，它计算出与该供体相互作用的分子的最小数量，以解释给定的荧光寿命变化。通过这种方法，曼氏金融_D特别适用于基于相互作用蛋白的最小相对浓度的相互作用发生的即时、动态读数。

的曼氏金融_D框架非常适合STELLARIS平台，因为它的理念是直接访问TauSense提供的基于生命周期的信息(图1和参考)。为了利用荧光寿命潜力定量读出烦恼，我们已经实施了曼氏金融_D作为一个新的TauSense工具，叫做TauInteraction。TauInteraction的工作原理如下(图1)烦恼实验中可能会有一些分子(供体和受体)会靠近。如果这些是随机事件，发生的分子的平均数量烦恼可以忽略不计。相反，如果分子之间存在积极的相互作用，则它们保持接近的时间将转化为供体荧光寿命的降低值。如果发生这种情况，TauInteraction将报告导致这种变化的分子比例。结果是在动态(即在图像采集期间)生成的一个taauinteraction地图，其中包含在像素级相互作用分子的分数。此外，提供了供体的荧光强度，允许使用基于强度的独立分析烦恼如果需要工具。

作为TauInteraction如何将分子相互作用转化为定量读数的一个例子，我们首先用串联结构评估了它的实现，用与短氨基酸序列相连的蛋白质表达供体-受体荧光蛋白对(eGFP-mCherry) (Tramier M等人，2006年)。这个结构显示了一个恒定的正数烦恼瞬时转染活细胞的行为(见图2)。这是27 - 29%的相互作用分子。这与最大可观测值一致烦恼在生物样本中(Padilla-Parra S et al. 2009)。如果我们有不同的供体和受体分子，相互作用的比例将低于这个最大值。如果我们降低供体分子的数量，我们可以模拟这种情况。这很容易通过光漂白一些mCherry信号来实现。在光漂白部分受体并湮灭相互作用后，我们观察到样品中相互作用分子的总体比例下降了约50%(图2)。

TauSense基于生命周期的工具(如TauInteraction)在STELLARIS上的集成为研究人员的研究铺平了道路烦恼以稳健和可量化的方式进行过程-最终目标是获得生物相互作用的功能答案。