宽场与共聚焦显微镜的基本比较
在WF显微镜中,显微镜阶段的整个样本将暴露于光源。最基本的宽野外显微镜形式是'BrightField显微镜',其中整个样本由上面(倒置配置)或下方(在标准直立显微镜中)被白色光照射。
在一个共聚焦激光扫描显微镜,是激发荧光的光源染料和蛋白质来自作为整个共焦系统的一个组成部分的激光单元。共聚焦显微镜的主要优点是可以选择用户定义的感兴趣区域否定对整个样本的需要暴露于荧光光源。另外,共聚焦显微镜可用于通过样本获得光学部分,该样本可以具有不包括大部分焦点或背景荧光的优点。
标准的WF显微镜没有共聚焦显微镜复杂,共聚焦显微镜通常由一个白光和荧光光源、显微镜和照相机(带或不带计算机)组成。在共聚焦系统中,显微镜本身只是包括激光单元的结构的一部分。扫描头'(含有针孔,用于排除焦点光线和光电倍增管从标本中收集光子)和计算机用于控制系统中的多个参数以及图像处理。
比较宽场和共聚焦显微镜的光源
在传统的激光扫描共聚焦显微镜中,大约五个不同激光源可能需要覆盖常用荧光团的激发波长。例如,常用的激光器是氩离子激光器,其可以产生由过滤器选择的一系列激发波长。氩离子激光器覆盖激发光谱的绿色波长,用于激发荧光团,例如FITC(异硫氰酸荧光素)。激发光谱的黄色至红色波长被氦氖激光器覆盖,范围约为543至632纳米。这种光谱被用来激发得克萨斯红和罗丹明等荧光团。
在发光二极管(LED)作为WF显微镜的荧光光源被引入之前,激发光的主要光源是气弧灯,这些光源至今仍被广泛使用。在WF显微镜中常见的两种弧光灯是汞弧光灯(也称为“水银燃烧器”或“汞蒸气灯”)和氙弧光灯。水银弧光灯提供的激发波长跨越大部分可见光谱(s.图2),然而,这种照明不是均匀的,主要的峰在近紫外光(紫外线)波长(313,334,365,405,436 nm),绿黄两峰分别位于546和579 nm。
与汞弧光灯相比,氙弧光灯提供的激发波长跨越大部分可见光谱,但在这个范围内的峰值不能达到汞燃烧器的强度。虽然氙气弧光灯不延伸到紫外线与水银燃烧器相比,它们的部分光谱激发范围进一步转移到红外波长。
虽然这些灯提供极强的光源荧光显微镜他们并非没有固有的问题。这些灯泡的使用寿命很有限,水银燃烧器的使用寿命通常为200到300小时,氙气弧光灯的使用寿命为400到600小时。因为显微镜的使用寿命有限,所以应该用显微镜仔细记录使用的小时数(尽管有些系统有内置的记录小时数的记录仪)。如果煤气灯在其推荐的使用寿命范围内使用,灯管有爆炸的危险。此外,如果定期打开/关闭灯泡,会显著减少灯泡的使用寿命,因此需要考虑到这一点。使用过的弧光灯应谨慎处理,并按实验室各研究所规定处理。在徕卡科学实验室(s.图3)的这两个教程中包括了更换和对齐这样的灯:
尽管上面突出的一些缺点,但由于所产生的光的强度,汞弧灯仍被认为是WF荧光显微镜的基本光源。
用于显微镜的新一代LED光源不仅提供了全谱的激发波长(从大约365到770nm),而且还提供与弧灯相当的强度。在弧灯上的主要优点是LED源的寿命,可以高达50,000小时,无需热预热或冷却时段。这也可以节省时间,因为LED单元仅在最初安装时只需要一个对准调整。最后,浪费是弧灯的问题,因此它们在显微镜旁边的特殊外壳单元中安装。由于具有LED的大部分电气输入被转换为光,因此它们实际上不会产生余热。
比较宽视场显微镜和共聚焦显微镜的图像捕获
如上所述,共聚焦扫描头包含一组光电倍增管(PMT用于从样品中收集光子。通常,共聚焦扫描头将包含至少三个PMT,该PMT负责收集红色,绿色和蓝光,但是额外的PMT对于收集传输或反射光是常见的。PMT的不是相机,而是由真空管组成,其在一端具有光子进入窗口,并且在管的主体中具有电子乘以组分。在最终组装并显示图像之前,收集的光子的量被转换为电信号。许多共焦系统还配备了类似于用于WF显微镜的摄像机。
WF显微镜的图像捕获由基于光电二极管的更传统的相机实现(见图4)显微镜摄像头包含半导体探测器,最常见的传感器是充电耦合器件(CCD)、互补金属氧化物半导体(互补金属氧化物半导体),斯科斯(科学互补金属氧化物半导体).两者有许多相似之处CCD和互补金属氧化物半导体相机,虽然它们以不同的方式处理图像信号,从而可以影响相机的捕获时间以及诸如信噪比的因素。帧速率CCD基于相机的相机可能比a慢10倍互补金属氧化物半导体传感器由于其功能中的内在性质。因此,相机的选择取决于感兴趣的标本的动态性质。
广角显微镜的配置
宽场显微镜是直立的,其中载玻片从下方照射,或者倒置,其中载玻片从上面照射,如图5所示。该配置对可以研究的样本有影响。直立显微镜通常用于固定样品的应用,安装在玻璃载玻片上。已经发明了倒置显微镜观察活细胞。它们通常在液体溶液中种植。只有下图的配置和样本上方的冷凝器只能保证对样本的物镜的近距离接近。
氟荧光是用来描述荧光显微术的术语,其中使用同一透镜(物镜)同时照亮和收集样本发出的光。光从光源传播,通过滤光片组,通过双色镜,较短波长的激发光通过物镜反射到样品上。样本发出的较长波长的光通过物镜返回,通过双色镜通过目镜成像和/或由照相机收集。
跨照相技术包括诸如相对比度和差分干扰的对比度方法(迪拜国际资本)显微镜。然而,透射荧光显微镜是一种方法,这是既不知名,也使用良好。这种方法不使用双色透镜,而是激发光通过聚光镜和标本,发射光被物镜收集。然而,该技术最初存在许多问题,如高背景、聚光镜和物镜的光学匹配困难[1].克服这些问题的最近进步使得在诸如此类的领域中使用过型荧光成像体内成像和牙科研究[2].
广角显微镜的对比方法
在宽场显微镜下分辨率
显微镜的分辨率仅仅是区分标本细节的能力。它是一个样本的两个不同点仍然可以看作是独立实体的最小距离。有关决定分辨率的概念和因素的更多信息,请阅读在这里.
与所有传统的光学显微镜系统(包括共焦)一样,分辨率是由数值孔径(NA)和光的波长决定的。在光学显微镜中,分辨率的极限在200纳米左右。在具有最高NA光学的完美对齐显微镜系统中,分辨率的极限大约是用于成像标本(或激发荧光团)的光波长的一半。将WF与共聚焦显微镜相比较,两种方法的分辨率的理论极限是相似的。
然而,通过WF显微镜实现的实际分辨率被背景荧光放大。如上图所示,整个标本在WF显微镜下被照亮,因此焦平面上下的区域也会发出荧光,并被相机捕捉到并被观察者看到。因此,荧光团的发射波长可能会被这种背景荧光所掩盖,从而导致信噪比整体下降,进而降低可实现的分辨率和对比度。
在一个共聚焦系统中,针孔(在扫描头内)用于阻止任何焦点光到达PMT检测器。尽管这具有通过阻塞背景和自动荧光产生急性聚焦图像的优点,但是一些焦焦光子可能具有源极面。这意味着由于针孔可能会丢失一些信息。在共聚焦系统上产生的锐利图像之间存在平衡,并通过WF显微镜无意中收集焦点。但是,使用被称为'的后期后进程解卷积'这可以解决模糊和聚焦(见图7)。这个计算过程可以重新分配光子到它们的原点。
扩展领域:简要介绍WF FRAP和超分辨率技术
虽然收紧先前使用共聚焦显微镜进行实验,还有WF的解决方案如今。与传统的基于共聚焦相比收紧实验,WF FRAP.设备可以提供更高的成像速度,具有最先进的相机,并且还保护感兴趣的感兴趣的细胞和区域免受共聚焦系统引起的过度光应力。
超分辨率显微技术那些可以超出大约200 nm的分辨率限制的那些。近年来,许多超级分辨率技术已经开发,其中包括:
- 单分子定位技术,其中小比例的荧光团信号收集随着时间的推移建立最终图像。顾名思义,如果实验条件允许,捕获和成像单个分子是可能的。
- 结构化照明显微镜(SIM)。在该技术中,在WF光的相位和幅度中产生图案。正在成像的样本还将产生类似的模式,并且基于样本的图案之间的干扰用于构建蜂窝内结构。
- 受刺激排放耗竭(st)显微镜。这种共聚焦技术需要两个激光器——一个用于激发荧光团,另一个圆形激光束“耗尽”来自同一荧光团的发射,从而获得更小的图像捕获区域。
具有WF显微镜可实现的单个分子定位技术之一被称为直接随机光学重建显微镜(dSTORM),或称为基态耗竭后的单分子回归显微镜(GSDIM).
GSDIM/dSTORM利用激光器和光可切换的荧光探头,关闭和接通,以随着时间的推移构建图像。大部分荧光探针被诱导成一个“暗状态”能级,在其上不能发射光子。这只留下单个和分离的荧光团,其可以具有纳米精度。