共聚焦显微镜的针孔效应

基于镜头的光学仪器主要涉及两个参数：镜头曲率和直径。曲率定义在哪个方向平行射线被偏转，直径定义了多少射线贡献到所得到的图像。直径可以简单地是镜片的框架，在许多情况下，它是界定光束直径的单独隔膜。常见的隔膜由薄膜制成，通过该薄膜控制隔膜的直径。但是，非常小的隔膜，不适合当前的薄片技术。产生非常微小的隔膜的最简单方法是用针头（销）刺破纸板或铝箔，因此称为针孔。这种针孔是“相机暗箱”的工作原理[1]

共聚焦显微镜允许光学分开样本的响应切片并将这些切片作为图像记录。最佳地，切片仅覆盖显微镜中产生的焦点。

为了实现这项任务，通过微小的光点扫描样本。可以产生的最小形状是衍射限制点。显微镜的焦平面中的衍射限制点是光斑形光源的图像，因此称为“点扩散函数，PSF”。PSF在成像无量纲斑点时，PSF是光学装置的焦点中的光分布。随着所有传统光源通常都没有点状但具有显着的延伸，光源突出在微小的孔径上，针孔，作为点形源。

在检测侧，传感器必须以相等的方式遵循。也就是说，感测区域也应该是衍射限制点，始终与照明点重合。这是通过类似的布置实现的：发射光通过微小的孔径，检测针孔进料，然后通过传感元件记录。这是这种检测针孔，当我们在共聚焦显微镜中提到“针孔”时通常被提及。

术语“共焦”是指确切的这种安排：照明和检测都集中在同一位置[2]．一致的焦点之一。然后像上世纪电视屏幕上的电子束一样，通过逐点扫描视场生成图像。扫描通常由一组数据透视表镜像来完成。

如图1所示[3]，检测针孔去除不源于焦平面的所有发射。因此，它也被称为“空间滤波器”，过滤焦深并阻塞自焦声信号。当器件通过光学手段切断从样品中的部分，它也称为“光学刀”。

对于一般的共焦成像，建议只通过针孔传输衍射限制特征的内部部分。这个内部部分被称为“艾里盘”。中间像中艾里盘的大小取决于波长(颜色)、数值孔径NA、物镜的放大率和显微镜内部光学的放大率。镜筒上刻有NA和物镜放大率。因此，不同的颜色和不同的物镜的NA和/或放大率所需要的针孔直径是不同的。

此外，可变针孔通过减少直径或通过增加直径来减少光学切片性能来提供对用户的自由度来增加光学截面清晰度。

如上所述，用于一般共聚焦成像的针孔应该通过通风盘。在这种情况下的直径被称为“通气单元，Au”。这是一个良好而实际的妥协，而不是自然的法律。当针孔增加时，越来越多的内外贡献将到达传感器，越来越雾化剧烈焦点信息[4]．因此，总体强度是增加，显然是信噪比（SNR）的信号似乎改善。但是增加是由于从焦平面外的层收集不需要的模糊信号。如果针孔（几乎）无穷大，显微镜表现得像非共聚焦宽场显微镜（见图3）。因此，通常不建议打开针孔只是为了减少图像的噪音。

横向分辨率不受影响并始终保持在宽野地成像和由Abbe的公式给出的价值：D =λ/ 2na（见图4）。

当针孔直径为零时，在轴向衍射极限处得到了最薄的光学切片。当然，这是不现实的。实际上，在衍射极限处切片的厚度只比衍射极限好25%[4]比在1个au。

除针孔直径以上1 AU以上，当针孔关闭时，横向分辨率也受到影响。在针孔零时，人们可以期望增加CA的横向分辨率。30％。通过在推荐的1AU下面稍微闭合针孔，可以部分地利用这种改进。例如，在0,6 AU，我们已经获得了58％的可能分辨率增加。为了仍然可以确保良好的信噪比，我们应该使用显微镜，对发射的荧光和几乎无噪音传感器具有非常好的效率。

关闭针孔以增加横向分辨率的替代方法是一种称为“图像重生”的方法[5]．这里，再次扫描衍射图案本身，并且将级分重新分配到相邻像素（参见图2，右侧）。通过计算新的合成图像，与宽场显微镜相比，横向分辨率可以增加大约1.4倍，几乎与等效的针孔直径几乎无关。但是，光学截面性能将假设整个扫描区域的光学切片性能，并遵循图3所示的关系。

1. 针孔相机（检索到2017年2月21日）
2. C.J.R.Sheppard，A. Choudhury：扫描显微镜中的图像形成。在：Optica Acta：国际光学杂志。24,1977，S.1051-1073，DOI：10.1080 / 713819421
3. BORLINGHAUS RT：所有颜色的白色共焦 - 微观光学切片。Springer International，Heidelberg（2017）ISBN 978-3-319-55561-4（印刷机）。
4. 威尔逊T：共聚焦显微镜中的分辨率和光学切片。微观杂志CHINESS。244，PT 2 2011，PP。113-121 DOI：10.1111 / J.1365-2818.2011.03549.x
5. de luca gmr等人：重新扫描共聚焦显微镜扫描两次以获得更好的分辨率。光学表达4：2644-56（2013）。