理论考虑因素
只要直径相当大，通过聚焦装置传递的Z方向上的PSF的差异由针孔直径控制。这是图1中所示的“几何光学元件”的范围。当直径在衍射图案的范围内时，衍射效果变得更加相关，并且针孔的直径不控制切片厚度。通过衍射（衍射极限），即通过波长和数值孔径（图1）来统治最小的可实现的光学部分。
定性地描述对针孔直径的依赖性的可能性是合并几何依赖性（真正的大直径）和图2中的公式中所做的衍射依赖性（真正的直径为零）（真正的直径零）。在该公式中，衍射限制价值（左汇总）和几何函数（ROWE SUMPAND）合并应用Pythagorean定理（经验方法）。
关于贡献应该使用的幅度存在不同的意见;给出的公式是一种实际妥协，其中衍射限制术语的幅度为1.注意到这些理论公式（通常粗糙）近似至关重要。正确（理论）值需要明确的照明和检测梁的卷积。更重要的是：真实的衍射模式取决于镜头设计和系统概念。因此，所有理论考虑因素都是拇指的规则 - 在最佳情况下。对于实际工作，建议不要夸大理论衍生。如果请求共聚焦系统的实际性能，则必须在Z方向上测量强度曲线，并分析全宽半最大值，以改变针孔直径，镜头调整，颜色和样品。
如何测量光学部分配置文件
为了在轴向上测量强度型材，显微镜必须配备电动聚焦驱动器。通常，该软件将提供用于获取3D图像堆栈的工具，或者 - 更优雅 - 一种称为XZ扫描的快速轮廓部分。通过在单个直线上扫描照明点，同时递增焦点位置来执行轮廓切片。显示的图像是通过样本切割的XZ。如果样品包含足够小于衍射有限分辨率的结构，则结构的图像是实际的PSF。通过这种XZ切割测量强度型材的软件包可广泛可用。
为了监视系统的性能，平面镜通常用作子衍射结构（当然，仅在Z Dircetion中真实）。与荧光相比，反射光共聚焦显微镜产生较薄的光学部分，但是样品制备和测量的执行有点简单。这些测量允许长时间监视系统性能或与其他系统进行比较。尽管如此，这是至关重要的，以确保适当的样品制备。例如，覆盖样品校正的油浸透镜需要覆盖有盖玻片的镜子，并在盖玻片的两侧安装有浸没油。Z定位必须优于Z分辨率，并且必须校准。必须校准针孔直径，应在0.5和2个气体盘直径（通风单元，Au）之间变化。
由于大多数应用意味着荧光，实际截面尺寸的测量应使用荧光珠。对于古典真正的共聚焦系统，直径50 ... 100nm的珠子是合适的。这些样品的制剂有点繁琐，荧光标记趋于随时间漂白。
测量对任何类型的样品缺陷，折射率不匹配，温度和其他参数非常敏感。为了避免不必要的挫折，只有经验丰富的显微镜操作员应该进行这些测试。
什么是适当的针孔直径？
如上所述，大针孔直径给出平滑图像，但不执行光学部分。完全打开的针孔类似于阔地显微镜（或多或少）。如果针孔非常小，则切片性能不会改善，但接近衍射极限。随着通过闭合针孔时，通过平方半径的光子的数量减小，图像变得不必要地嘈杂。良好的环境围绕从几何到衍射限制的过渡。这是直径刚刚覆盖衍射图案的内部结构，这也称为通风盘。该直径容易计算为Au = 1.21×L / Na，并且类似于由圆形孔产生的衍射图案的第一零内的区域。现代真正的共焦扫描显微镜自动将针孔直径设置为1 AU，如果修改系统参数。
