定位显微镜
常规荧光显微镜图像的分辨率受到发射光的大约一半的衍射限制。为了将荧光标记的结构分离在一起，需要解决方案来克服ABBE的衍射极限。用于超出衍射极限的最常见的超分辨率方法是定位显微镜，SIM（结构照明）和st（刺激发射耗尽显微镜）。
基态耗尽，然后单个分子返回(GSDIM)是一种定位显微镜技术。一般来说，定位显微镜观察的不是同时发射荧光团的集合，而是能够以纳米级精度定位的明显分离的单个荧光团。随着时间的推移，标记生物结构的每个荧光团的位置被确定，并基于每个荧光团的位置信息在硅中重建图像。目前的挑战是如何有效地使荧光团整体单一化，从而实现单分子检测。
GSDIM - 分子基础知识
关键的一步是GSDIM是暂时切换大多数荧光团，以允许单一荧光团的精确定位。为此，使用高强度的激发光以使样品中的几乎所有荧光团变暗，仅留下荧光的单个，分离的荧光团，这是纳米精密定位的先决条件。
图1(右):原理图GSDIM基于简化Jablonski图的方法。荧光团中的已分层π电子可以例如在地面态中0>，激发态S1(都是所谓的ON状态)或在一个三重或自由基暗状态(都是OFF状态)。当荧光发出时，电子在基态和激发态之间循环。与这些ON状态不同，OFF状态下的荧光团不能发光。这些关闭状态通常寿命很长，但是它们很难达到，因为需要系统间的交叉。通过在包埋介质中设置适当的环境条件，并通过聪明地选择用于免疫荧光的标准荧光团，可以通过极强的光强度激发荧光团来可逆地关闭它们。当足够多的分子处于OFF状态时，可以检测到样品中的单个分子。
分子态之间的过渡
一旦通过（激光）光激发荧光样品，电子通过光子弹射到第一个激发态。在从第1状态返回到地状态时，发出稍微较低的能量（红色偏移）。较高的激光功率增加了可以在接地状态下击中电子的光子的数量并将电子传送到激发态中。结果，在给定时间内地面和激发状态之间的样品循环中的更多电子。发出的光子的数量增加，并且可见更亮的样品。
进一步增加激发光(例如来自高功率激光光源)可以导致样品由于荧光发射减少而变暗。在这个过程的开始，激发光的增加导致更多的电子在基态和第一激发态之间循环。一定比例的电子从激发态进入离态。唯一可以从第一激发态得到的子态是三重态。进入三重态需要电子的自旋反转。一个自旋翻转的发生概率非常低，因此是一个非常罕见的事件。因此，在样品的弱光照射下，关态实际上是没有填充的。
关闭状态具有长的寿命（在μs至s的范围内），并且在OFF状态中具有电子的荧光团不能再参与样品的荧光发射。随着时间的推移，越来越多的电子在关闭状态下，样品出现调光器，尽管荧光团的总数没有改变。只有“有源”或“可访问”荧光团的数量已被改变。关闭状态下的“泵送”电子可以被视为可逆开关。荧光团被关闭时电子驻留在关闭状态。当电子返回到地状态时，荧光团被呈现为“活动”，并且可以再次发出荧光灯。电子电子之间的所有转变是概率治理的过程，因此不能预测给定电子的转换的精确发生。
定位达到纳米精度
对于超分辨率成像，激光功率保持在高水平，直到视野中的几个荧光团发射光子。“活性”荧光团可以在地面和第1激发状态之间循环高达几千千倍，在电子返回到关闭状态之前产生“突发”光子。使用高敏感的EMCCD相机记录光子“突发”。此外，只有少数电子填充地位，短时间内，导致“与个体分子返回的地面耗竭的情况”（GSDIM）.一般来说，发出光子爆发的荧光团在空间上是完全分离的，这使得某一区域内的所有光子都可以分配到一个分子中。在这种情况下，记录的衍射受限信号的中心与荧光团的位置相同。荧光团的位置可以计算到纳米级精度。
图3(右):外场与GSDIM．Golgi膜蛋白吉他素和Golgi基质蛋白GM130，分别用Alexa Fluor 647和Alexa Fluor 488染色免疫荧光染色。由日本东京大学医学研究生院Celtehi Okada博士提供雅士施奥达达博士。
为什么有机荧光团更好
超分辨率图像的最终分辨率取决于a)每个荧光团的定位精度(定位精度)和b)标记感兴趣结构的单个荧光团之间的最小距离(染色密度)。染色密度可能受到影响，例如免疫染色期间使用较高的抗体浓度。定位精度依赖于从单个荧光团收集到的光子数量，可以用以下公式来近似:
Δr:显微镜/物镜的衍射极限
N:单个局部荧光团发射的光子数
Δ短信:单个荧光团的定位精度
因此，为了达到10nm的定位精度，必须用衍射极限分辨率为200nm的显微镜从荧光团中收集400个光子。首先，发射的光子数量是荧光团与嵌入介质结合的特性。一般来说，有机荧光团比荧光蛋白具有更高的亮度和光稳定性。因此，这些染料传递的光子数量大大增加，定位精度显著提高。最后，由于定位精度的提高，利用有机荧光团等“更强”的染料可以获得更好的超分辨率图像!
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