分辨率和数值孔径
数值孔径(NA)与光通过的介质的折射率(n)以及给定物镜的角度孔径(α)有关(NA= nxsin α)。显微镜的分辨率不仅取决于物镜的NA，还取决于整个系统的NA，考虑到显微镜冷凝器的NA。更多的图像细节将在一个显微镜系统所有的光学元件都正确对齐，NA值相对较高，彼此工作和谐。分辨率还与用于成像标本的光的波长有关;波长较短的光比波长较长的光能够分辨出更多的细节。
在处理分辨率时需要考虑三个数学概念:“阿贝衍射极限”、“艾里盘”和“瑞利准则”。下面按时间顺序逐一列出。
George Biddell Airy和'Airy Discs'（1835年）
George Biddell Airy（1801-1892）是英国数学家和天文学家。到1826年（25岁）他被任命为三位一体大学的数学教授，两年后，他被任命为新剑桥天文台的天文学教授。从1835年到1881年，他是“天文学家皇家”，他有一个被称为他荣誉的农历和火星火山狼。
同样在1835年，他在剑桥哲学社会的交易中发表了一篇论文，剑桥哲学社会的交易题为“圆形光圈”的对象玻璃的衍射。Siry非常从一个天文学家的看法写了这篇论文，并且他描述了“围绕一个明星的形象的环或光线的形式和亮度”，如在一个好的望远镜中看到的“。尽管在不同的科学领域写作，这些观察结果与其他光学系统相关，实际上是显微镜相关的
一个艾里斑是最佳聚焦的光点，其可以通过通过衍射限制的完美对准的系统中的圆形孔来确定。从上面观看（图1），这看起来是一个亮点，它是同心环或涟漪（更正确称为通风模式）.
衍射模式是由光的波长和光通过的孔径大小决定的。艾里盘的中心点包含了大约84%的光强，剩下的16%在这个点附近的衍射图案中。当然，在显微镜下观察的标本中有许多光点，而用许多艾里斑来考虑比用术语“艾里斑”描述的单个光点更合适。
如图1的下半部分在图1的下半部分中所示的空气图案的三维表示也称为“点扩散函数”。
恩斯特·阿贝和阿贝的衍射极限(1873)
恩斯特·卡尔·阿贝(Ernst Karl Abbe, 1840-1905)是一位德国数学家和物理学家。1866年，他与卡尔·蔡司(Carl Zeiss)相遇，共同创立了蔡司光学公司(Zeiss Optical Works)，即现在的蔡司。此外，他还于1884年共同创立了Schott Glassworks。阿贝也是第一个定义这个术语的人数值孔径．1873年，阿贝发表了他的理论和公式，解释了显微镜的衍射极限。阿贝认识到样品图像是由许多重叠的、多强度的、衍射受限的点(或艾里盘)组成的。
为了增加决议(d=λ/ 2na)，试样必须用更短的方法观察波长(λ)光或透过较高的成像介质折射率或者与光学元件有一个高NA.（或者，确实是所有这些因素的组合）。
然而,即使考虑到所有这些因素,限制在一个真正的显微镜系统仍有些限制整个系统的复杂性,玻璃在波长400纳米以下的传播特征和实现高钠在完整的显微镜。一个理想的光学显微镜的横向分辨率限制在200纳米左右，而轴向分辨率限制在500纳米左右(分辨率限制的例子，请见下文)。
约翰·威廉·斯特拉特和《瑞利准则》(1896)
瑞利三世男爵约翰·威廉·斯特拉特(John William Strutt, 1842-1919)是英国物理学家和多产作家。在他的一生中，他写了惊人的466篇出版物，其中包括430篇科学论文。他的作品涉及范围广泛，从鸟类飞行、心理研究到声学，1895年，他发现了氩(他后来因此在1904年获得了诺贝尔物理学奖)。
Rayleigh built upon and expanded the work of George Airy and invented the theory of the ‘Rayleigh Criterion’ in 1896. The Rayleigh Criterion (Figure 2) defines the limit of resolution in a diffraction-limited system, in other words, when two points of light are distinguishable or resolved from each other.
使用通风圆盘理论，如果两个单个通风盘的衍射图案不重叠，那么它们很容易区分，“良好的解决”，并据说满足瑞利标准（图2，左）。当一个通风盘的中心通过另一个衍射图案的第一最小值直接重叠时，它们可以被认为是“刚得到解决”，并且仍然可区分为两个单独的光点（图2，中间）。如果通风盘比这更靠近，那么它们不符合瑞利标准，并且是“未解决”作为两个不同的光点（或在样品图像中单独的细节;图2，右图）。
如何计算显微镜的分辨率
考虑到所有上述理论，很明显，在计算解决的理论限制时有许多因素需要考虑。分辨率也取决于样本的性质。让我们来看看使用ABBE的衍射限制计算分辨率，也可以使用瑞利标准来计算分辨率。
首先，应该记住：
NA= nxsin α
式中n为成像介质的折射率，α为物镜角孔径的一半。物镜的最大角度孔径在144º左右。这个角的sin / 2等于0。95。如果使用折射率为1.52的油浸物镜，则物镜的最大NA值为1.45。如果使用“干燥”(非浸泡)物镜，物镜的最大NA值将为0.95(因为空气的折射率为1.0)。
横向(即XY)分辨率的Abbe衍射公式为:
d =λ/ 2 na
λ是用于成像标本的光的波长。如果使用514nm的绿灯和Na为1.45的油浸没物镜，则分辨率的（理论）的限制将是177nm。
轴向(即Z)分辨率的阿贝衍射公式为:
d =2λ/ na2
同样，如果我们假设波长为514 nm，观察一个NA值为1.45的标本，那么轴向分辨率将为488 nm。
瑞利准则是一个基于阿贝衍射极限的稍微精炼的公式:
r =1.22λ/ naobj + nacond
λ是用于成像标本的光的波长。NAobj是目标的NA。NAcond是冷凝器的NA。“1.22”这个数字是一个常数。这是由瑞利对贝塞尔函数的研究推导出来的。这些是用于计算系统中的问题，如波的传播。
考虑到冷凝器的NA，空气(折射率为1.0)一般是冷凝器和载玻片之间的成像介质。假设冷凝器的角度孔径为144º，那么NAcond值将等于0.95。
如果使用514nm的绿色灯，则具有1.45的Na，冷凝器的油浸没物体，Na为0.95，然后（理论）分辨率的限制为261nm。
如上所述，用于成像标本的光的波长越短，就能分辨出越多的细节。因此，如果使用最短可见光波长为400 nm，使用NA为1.45的油浸物镜和NA为0.95的冷凝器，则R等于203 nm。
为了在显微镜系统中实现最大(理论)分辨率，每个光学元件都应该是可用的最高NA(考虑到角孔径)。此外，使用较短波长的光来观察样品将增加分辨率。最后，整个显微镜系统应该正确对准。
