优秀GSDIM超分辨率图像实用指南

kees：我一直对换句话说，换句话说，换句话说，换句话说，换句话说，我一直对何种东西进行了兴趣。生命是分子的数量和类型，在他们的详细定位和互动中。

大多数分子不能看到，甚至没有理想的显微镜。它们没有颜色并且太小。在过去几年中，巨大的进步是着色的着色：我们在所有颜色中都有荧光蛋白才能标记蛋白质，我们有探针染色DNA的特异性部分，我们有能够看到像这样的小分子信使的传感器加利福尼亚州^2＋还有很多。通过这些，允许我们在时间和空间中遵循这些隐形分子。但只有光学显微镜的分辨率，即决数越来越多的分辨率比我们需要看到分子。

功能性成像技术就像荧光共振能量转移(FRET)那光漂白后荧光回收（FRAP）和荧光寿命成像(FLIM)让我们看分子相互作用。但是，只有0.25μm的分辨率，实验只有劳动密集型。还必须认识到，即使两种分子相互作用，这种实验的结果也可能是阴性的。

GSD和超分辨率是获得足够分辨率的逻辑下一步，以研究分子及其相互作用（图1）。

kees：当我们开始研究徕卡SR GSD定位显微镜我们广泛地研究了样品漂移使用不同的商业盘子和安装程序。通过分析亚分辨率荧光珠(Invitrogen)从盖玻片上拍摄的长时间延时成像系列，Chamlide CMB磁室(韩国首尔活细胞仪器)被发现有最小漂移。另外，我们将样品在成像前20分钟放置在显微镜台上，让样品稳定下来。如果x/y漂移很明显，我们通过使用自制的“去抖动”例程或分析软件包雷雨来做一个校正例程。

我们发现，在图像采集期间可以在这些已经令人印象深刻的图像中引入，尤其是当背景非常高时。现有的背景减法仅部分解决了这一点。因此，我们与来自阿姆斯特丹大学（UVA）的Eelco Hoogendoorn和Marten Postma一起实施了新的背景减法方法：运行的时间平均中值过滤器（图3）。这有效。［2］

然后，我们发现，在如此高的放大率下，在衍射有限世界中没有被忽视的小图像误差不能再被忽略。正如我们实验室的Daniela Leyton所示，那样，色差明显可见，他正在研究在刺激细胞后易于转移到质膜的蛋白质。问题是它是否易于血浆膜脂双层，或者仅与恰好与之相邻的皮质肌动蛋白相关，这是一个似乎针对超级分辨率量身定制的问题。

最初，Daniela发现Clic4几乎总是在脂质双分子层旁边，但根据细胞的方向，它们有时出现在细胞内，有时出现在细胞外。我们和物理学家Bram van den Broek一起，对嵌在基质中的0.1µm Tetraspec微球进行了红色、绿色和蓝色通道的成像，他们认为色差是原因。有了这些数据，我们量化了色差，并能够使用自制的Image J宏用仿射变换矩阵精确地校正它们(图4)。［3.］

请记住，色差取决于使用的目标，必须单独纠正，但曾经是一旦表征，校准仍然有效。

Daniela还花了很多时间来比较用于超分辨率显微镜的固定协议。固定伪影的发生 - 以及如何处理它们 - 在电子显微镜下良好记录。然而，不能简单地复制这些协议，因为SR成像是因为制剂通常在水缓冲液中成像。

对于肌动蛋白细胞骨架和相关肌动蛋白结合蛋白的联合成像，通过Leyton-Puig等2016年的方案获得了最佳结果。［4.］

kees：许多!太多了，不能一一提及。例如，我们观察到半脂质体的分子组成，即确保你的皮肤不会从身体其他部位脱落的粘附结构，并不完全像早期电子显微镜和广角荧光显微镜所认为的那样。

我们发现，DNA片段可能会进入核膜内小叶层膜网络的空白区域(一种口袋)。我们正在研究细胞骨架成分，细胞表面受体和囊泡蛋白，所有这些都带来了新的科学见解，也带来了新的科学问题。另一个惊人的发现是，中间的丝网似乎与微管密切相关，这主要见于细胞的外围。这项技术非常强大，以至于我们不断地收到希望协作的组的请求。

另一个重要的洞见是，定量图像分析是迫切需要的，而且比以前更触手可及。其分辨率远优于荧光显微镜，标记密度远优于新兴市场，我们可以开始计算集群中的受体的数量，以定量长丝与锚定它们的蛋白质之间的距离，我们可以定量两种不同分子种类的空间分离等等。但传统的工具，如官员系数或皮尔逊相关系数不再适用！单分子本地化根据定义不重叠，所以我们必须提出问题：两个分子物种平均如何接近？这需要新的分析工具。［5,6,7,8,9.］

kees：新的sCMOS相机在我们手中有几个优势。它在~ 500hz时提供(几乎)相同的图像质量，即大约5倍于CCD.．相机可以做到1500Hz，但在这种情况下，我们没有收集足够的光子以获得最高质量的图像。

5倍的速度意味着在你的缓冲耗尽之前要做5倍的实验，漂漂更少，漂漂更少。它在低功耗模式下(40 x 40µm视场)也工作得非常好。

但最令人兴奋的是我们开始在活细胞中做GSD。我们早期发现，当488纳米激光激发时，mVenus闪烁得很好。