FRET——原则
Förster共振能量转移(烦恼)描述了存储在受激荧光分子(供体)中的能量到其附近的非受激不同荧光分子(受体)的非辐射转移。必须满足三个条件烦恼进行：
- 施主发射光谱与受主激发光谱重叠(图1)
- 分子必须在纳米（10微米）范围内非常接近–9m)比例(图2-4)
- 分子必须有适当的相对方向
的影响
因为它与r有很强的距离依赖性–6（图4）烦恼发生在与生化反应高度相关的空间尺度上，如蛋白质-蛋白质或蛋白质- dna相互作用。烦恼可以通过灵敏的荧光读数探测分子间的相互作用。这使得研究人员能够在体外和体内研究分子间的相互作用。通过用合适的荧光标记连接两个感兴趣的相互作用伙伴，可以分析双分子相互作用。或者，烦恼允许构建生物探针报告第二信使浓度或离子强度通过分子内的手段烦恼由于强烈的构象变化。
毫不奇怪，烦恼已发展成为细胞生物学、生物物理学和生物医学成像中广泛使用的工具。188bet怎么注册
方法论
有不同的检测技术烦恼在显微镜下。常用的技术是基于施主(受主-光漂白，烦恼AB)或受体(敏化发射，烦恼SE)。
基于强度的烦恼可以很容易地使用标准共焦显微镜。但是，它也有一些缺点。烦恼AB不能用于时间序列实验，且易引起供体分子的可逆光漂白或光转换。烦恼另一方面，SE受到光谱串扰的困扰烦恼对，并需要仔细的校准测量，以及产生的图像的线性分离。本申请信介绍了一种不同的测量方法烦恼这是基于荧光寿命成像显微镜(这部电影）.
荧光寿命
荧光的过程通常被理解为从电子基态(S0)变为激发态(S1)(图5，左)。这种跃迁可以由具有适当能量(即频率或波长)的入射光引起。吸收的能量会被荧光分子储存一段时间，然后以荧光的形式释放出来。分子处于激发态的时间称为荧光寿命。它通常是纳秒级的(10–9对于许多有机染料和荧光蛋白。
荧光寿命和FRET
从激发态放松的另一个过程是，例如，烦恼通过烦恼激发能以非辐射方式转移到受体分子。受体反过来可以通过荧光松弛（图5，右图）。由于施主荧光和能量转移是相互竞争的过程，因此在存在荧光的情况下，消耗激发态的速率增加烦恼．有人可能会说，供体分子处于激发态的时间越长，这种可能性就越大烦恼发生。只有来自施主分子的光子被荧光所松弛，才能被观察到。由于受体荧光波长较长，无法检测到转移到受体分子的能量。因此烦恼缩短供体寿命（图6）。
荧光寿命成像（FLIM）
的徕卡SP8猎鹰使用脉冲激光器和单光子计数探测器在时域测量荧光寿命。寿命是通过建立检测到的荧光事件的直方图来确定的。这显示了单指数或多指数荧光衰减。数值曲线拟合显示荧光寿命和振幅(即探测到的光子数)。
菲姆-弗雷特
自烦恼减少供体寿命的程度可以量化烦恼发生，前提是施主生存期没有烦恼是已知的。施主寿命τ作为一个绝对参考烦恼样品进行了分析。因此,这部电影-烦恼内部校准–这一特性缓解了基于强度的烦恼测量。由于其荧光寿命是染料的固有特性，因此它对其他有害影响（如光漂白、图像着色、不同浓度或表达水平）具有广泛的不变性。
使用强度的主要限制为基础烦恼测量是所有可观察到的施主分子都经历烦恼．通常情况并非如此。供体分子的“未结合”分数的变化给测量结果带来了相当大的不确定性烦恼效率，使得实验之间不可能进行比较。这部电影-烦恼克服了这个缺点。
使用活细胞记录FLIM图像
如前所述烦恼根据微动施主寿命τ的比率计算效率解渴在非微动寿命τ为:
为此，必须通过使用仅包含施主的样品进行测量来了解τ。排除受主的任何发射非常重要。使用外部探测器时，必须使用带通滤波器。可以调整内部探测器以仅记录施主发射。同一设置也必须用于仅包含施主的测量l作为使用烦恼样本。
活细胞中的CFP-YFP FRET
在这项工作中，我们使用培养的RBKB78细胞瞬时转染烦恼两个FPs由两个氨基酸的短连接物连接[1]．这种供体-受体融合也可以作为一个良好的正控制烦恼在真实场景中。“仅供体”样本由仅转染CFP的相同细胞组成（图7A）。作为第一个近似值，平均寿命用fast计算这部电影模式，只有捐献者和烦恼示例(图7 b)。寿命分布直方图表明，供体寿命τ的平均寿命为2.1 ns(图8)烦恼Construct是1.4 ns。获得一个烦恼效率E=1–（1.4/2.1）=33%。
顶行：图7：仅转染CFP供体（a）和CFP-YFP融合体（B）的RBKB78细胞。使用光谱法将检测带设置在445–495nm之间这部电影探测器。颜色区域已被用于分析。颜色代表强度调制荧光寿命。由格雷戈瑞W HARMS教授，德国W·兹堡堡大学。我们承认Benedikt Kr SuMr博士（PioQuANT，柏林），Jan Hendrik Spille和Wiebke Buck的实验支持。
图8:仅供体荧光寿命分布(黄色)和烦恼(绿色)使用平均寿命的样品。寿命明显缩短0.7纳秒烦恼样本。
FRET与无FRET的比率
众所周知，CFP本身至少有两个生命周期组件[2, 3].此外，我们也不知道所有被研究的分子是否都经历了烦恼．为了更好地处理这种复杂性，我们需要获得比平均寿命更长的信息。我们可以进行双组分匹配，这将给我们两个寿命和两个振幅。后者允许我们估计一个生命周期相对于另一个生命周期的相对比例。特别地，利用振幅，我们可以估计分数显示的相对比例烦恼(束缚分数)和未显示的分数烦恼(未装订的分数)。具有弱次级分数的FPs，如EGFP或Sapphire，是这种类型分析的理想选择。
参考文献
- He L, Olson DP, Wu X, Karpova T, McNally JG, Lipsky PE:一种通过直接观察CFP-YFP荧光共振能量转移过程中供体荧光团猝灭来检测活细胞中蛋白-蛋白相互作用的流式细胞术(英文)烦恼).细胞仪A部分55A（2003）71-85。
- 艾尔H，亨德森JN，雷明顿SJ，坎贝尔RE：克拉维亚青色荧光蛋白的单体、明亮和耐光版本的定向进化：荧光成像中的结构表征和应用。生物化学J 400（2006）531–40。
- Jose M，Nair DK，Reissner C，Hartig R，Zuschratter W:Clomeleon的光物理这部电影:在神经元发育过程中识别激发态反应。中国生物科学(英文版)。
