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无标签的Flim

生理条件下的显微镜故障

许多生物样本显示自体荧光。它的广谱会干扰荧光标记策略。本申请书展示了自体荧光如何在荧光寿命成像显微镜中作为一种内在对比(这部电影)导致多色图像叠加。本文还概述了如何结合光谱成像和荧光寿命信息来区分和识别生物样品中不同的荧光物种。

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显微镜与自发荧光

在荧光显微镜中,自体荧光通常被认为是许多生物样品固有的有害副作用。它倾向于与内源性荧光标记重叠,有时会掩盖其强度。它会导致光谱通道分离和强度定量比率分析的困难。自发荧光的发射光谱通常非常宽,这使得传统的光谱图像记录难以实现。

然而,自发荧光也有其优点。它是一种自由的荧光标记的内在形式,是完全无侵入性的。本申请字母的目的是通过荧光寿命显微镜显微镜识别几个自发荧光组件(这部电影)并展示他们在生物医学研究中的效用。188bet怎么注册

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自体荧光符合科学

大多数生物样品含有能产生自身荧光的生物化学物种。例如,细胞的氧化还原电位反映在其NAD(P)H和黄素的浓度上。前者更让人兴奋红外源,后者也可以使用405纳米。相当多的结构蛋白也可以提供寿命对比,例如胶原蛋白,弹性蛋白和纤维蛋白。

植物细胞特别富含多种自发荧光分子。很常见是叶绿素,类胡萝卜素,多酚到名称,但几个。通常,这些化合物不仅可以提供无标记的对比度,还可以提供有关细胞或组织中的代谢状态或致病性改变的信息。因此,可以通过组合汲取功能的结论这部电影和自体荧光。

无标记对比

举例说明自发荧光的实用性作为生物样品中的对比策略,我们将分别检查动物和植物王国的一个例子。

让我们从介壳虫开始。收集不同发育阶段的这种植物寄生虫,并立即安装。使用10倍物镜记录了在激发波长470 nm处的自发荧光的总览图像(图1)这部电影数据集并产生标本结构的良好表示。此处的强度编码每个像素的计数光子,而不是标准强度图像的常规单位。然而,它无法区分任何自发荧光物种(图1a)。该信息包含在寿命图(图1B)中,其使空间分辨的寿命分布呈现。它给出了不同荧光寿命部件的良好印象。

在自发荧光方面,这通常代表不同的分子种类或其组合。我们可以在天线和腿部(绿色至蓝色)围绕一定少量的小脑骨骼区分。几丁质显示出非常短的一生。周围的组织看起来相对均匀接近3 ns(黄色)。一些具有较长寿命(橙色)的散射区域可以代表其他物种,而是这里,它们更可能代表在确定寿命时简单地具有较低精度的较暗区域。

通常被认为和传达的内容这部电影图像实际上是强度调制的寿命图(图1c)。寿命信息乘以强度图像。该再现倾向于使光子统计差的较差区域进行脱模,并且它保留了强度图像中包含的更多结构信息。后者通常促进寿命的解释,就像寿命图中的橙色区域一样。我们可以得出结论这部电影允许我们在不受干扰的样品中识别不同的分子种类,并研究它们的空间相互关系。

图1:蚧虫自身荧光图像(腹侧图)。强度图像(A),生命周期图(B,背景裁剪)和强度调制生命周期图像(C)。生命周期图显示了至少三个不同颜色编码生命周期的空间分辨率。长度为1.5 mm,截面厚度为1.3 μm。扫描格式280 × 512,物镜10 × NA 0.4,激发波长470 nm,探测发射波长478 ~ 703 nm(样品由荷兰阿姆斯特丹NCI Kees Jalink提供)。

深度 - 3D Flim堆栈

仔细观察自动荧光图像(图1),我们可以识别出天线,例如,外面有蓝色区域,里面有绿色区域。那么,绿色区域代表的是一种独特的物种,还是甲壳素荧光(编码为蓝色)和周围组织(编码为黄色)的(光学)混合物?为了解决这个问题,我们可以在更小的地区使用更高的NA目标。我们还必须考虑图像的z向扩展。为了更好地可视化结构的内部,我们可以记录一个这部电影结果表明,寿命较短是由于几丁质造成的,因为天线内部与中间部分显示的周围组织寿命相同(图2A,白盒子)。现在可以使用z堆栈的最大投影在扩展焦点下查看厚结构(图2B)。等值面渲染(图3)可以帮助更大程度地欣赏三维拓扑结构。注意,关节中没有甲壳素,这在图中清晰可见这部电影数据。重要的分类分类功能变得可见,例如散发在所有身体段的发型砂岩。它们显然还含有几个丁蛋白物种。

图2:这部电影z堆栈的鳞片昆虫天线。使用40X NA 1.25透镜(A)记录了40 Z切片的约1μm深度。器官的最大投影显示天线和一些小毛发(B)。使用外部软件完成最大投影。视野为388 x151μm。

多色自发荧光

植物的荧光成像往往受到叶绿素和一些细胞壁成分以及内源色素等荧光物质的影响。在这里,我们利用这些固有的自荧光团来对比其他差的结构。我们记录了百合花粉粒(小孢子)的z形叠加(图4)。花粉粒的花药呈橘黄色,肉眼可见,透射光也可见(图中未显示)。例如,植物王国中可能存在的黄色荧光色素是类胡萝卜素。我们获得了从0.5到1.2 ns的寿命。两个主要的结构特征与寿命形成了鲜明的对比。在绿色中,我们可以看到管状细胞的网状外层,它围绕着核心(蓝色表示0.5 ns)。z -切片显示,短寿命物种并没有填满岩心,而是在管胞周围形成了一层薄薄的内层(图4A)。扩展焦点(图4B)和3D可视化(图4C)有助于阐明这两个层之间的相对拓扑结构。

图4:来自LIIM SP的微孔(花粉粒)。(百合花)。470nm的自荧光激发揭示了管电池外层中的两个结构上不同的荧光物质。45 Z切片以482nm至744nm(a),使用外部软件(b)和3D异位表面渲染的482nm 0.7镜头检测从482nm 0.7镜头检测发射。孢子的纵向延伸是130μm。

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