用一种新型荧光珠测量三维ted - psf

在过去的二十年里，超分辨率显微镜技术已经被用于生物研究［1］．在众多超分辨率技术中，受激发射损耗显微术已经被采用为一种强大的超分辨率扩展共聚焦显微术[2]．具有在小于30nm范围内解析活性样品结构的潜力，受激发射损耗非常适合于单蛋白规模的活细胞研究。受激发射损耗在过去的十年中，显微镜技术得到了广泛的发展和改进，但准确地描述和测量显微镜的三维点扩散函数（PSF）仍然具有挑战性受激发射损耗系统。

在受激发射损耗在显微学中，PSF的形状不仅取决于显微镜的光学，而且还取决于特定的因素，如光学受激发射损耗激光功率和试样本身的荧光行为[3]. 这些参数是根据仪器设置和典型荧光团参数估算的。存储在测量元数据中的参数和估计值可用于计算理论PSF。PSF的形状（见图1）决定了显微镜可达到的空间分辨率，这是执行反褶积的必要前提。

GATTAquant是一家为显微188金宝搏怎么注册镜市场开发产品的公司，最著名的是他们的纳米尺样品，它允许精确测试荧光的可实现的空间分辨率，特别是超分辨率显微镜[4,5]．使用所谓的DNA折纸技术，GATTAquant最近开发了一种新型荧光珠，称为GATTA珠。利用DNA折纸技术，可以在纳米尺度上制造出数十亿个相同的物体，这些物体可以用作有机染料分子的分子面包盘。因此，有机染料分子可以以纳米精度和规定的距离定位，以防止猝灭，从而降低样品的有效亮度。通过这种方式，GATTA珠子的每体积亮度密度非常高。与传统荧光珠相比，GATTAquant提供的新型荧光珠显示出一些优势特性：

• GATTA珠子经过优化，每体积可提供大量无相互作用的染料分子。由于染料分子的猝灭，进一步添加染料分子会降低珠子的有效亮度。如图2所示，染料分子荧光寿命的窄分布也表明没有猝灭。
• DNA折纸技术的使用产生了数十亿在大小和形状上基本相同的结构，这对于测量的PSF是特别重要的受激发射损耗显微镜。单分散粒径的荧光珠与传统荧光珠相比，亮度分布非常窄，如图2所示。
• GATTA珠子用常见的有机染料分子进行标记，这些分子在生物应用中最为人所知，例如菁染料、Alexa染料或ATTO染料。使用同一种类的染料，因此在生物样品的后续测量中使用相同的光谱特性，可以产生与反褶积有关的真实结果受激发射损耗测量和PSF的一般测量。此外，GATTAquant还提供定制荧光珠的服务。这些珠子基本上可以用任何染料分子进行标记，最终可用于任何任意组合的多色珠子。
• 除了有机染料分子外，GATTA - Beads还可以用生物素等连接分子进行标记。这提供了将珠子固定在各种表面上的可能性，如标准盖或载玻片。
• GATTA珠可在溶液中使用，用于非常灵活的样品使用，或作为现成珠，固定并嵌入到盖玻片上。使用支持光稳定性的嵌入介质，以显著保持初始亮度。由于GATTA珠子提供的高亮度密度和每个结构的大量染料分子增强了光稳定性，因此可以测量每个结构的三维PSF受激发射损耗显微镜。

上述特性使GATTA珠成为荧光显微镜各种应用的理想工具。下一节将介绍一个非常突出的应用，即测量最先进商业设备的三维PSF受激发射损耗徕卡微系统显微镜，进一步用于188金宝搏的网址惠更斯软件的反褶积。

采集到的珠子图像是系统点扩散函数的间接测量方法。为了获得系统的多聚砜，需要一个额外的多聚砜蒸馏过程[6,7]．

荧光显微镜中的图像形成可以用包含(泊松)噪声的卷积过程来描述。反卷积的目的是通过PSF和噪声的知识从测量图像中恢复未知的目标。在PSF蒸馏中，对象是已知的，并被建模为一个直径为20纳米的球体。PSF是这个逆问题中的未知函数。采用非线性极大似然估计方法，类似于反褶积算法，反转目标函数和PSF的作用［7］．PSF蒸馏的目的是找到最可能生成测量图像的PSF。这个过程如图3所示。

惠更斯PSF蒸馏器(惠更斯专业科学体积成像B.V.)用于从采集的珠图像中提取PSF(图4)。惠更斯PSF蒸馏器是一种基于向导的软件工具，可以帮助从珠图像中提取PSF。这些数据包括记录为独立图像的多个珠子，或同一图像中的多个珠子，或两者的组合。PSF蒸馏器使用非线性迭代方法从珠图像中提取PSF。蒸馏器向导自动从图像中选择最合适的珠子，将珠子居中，并累积它们以平均噪声，如图5所示。

通过使用GATTA - Beads和SVI Huygens软件，徕卡的三维PSFTCSSP8受激发射损耗测量并蒸馏两个光谱区域的3X超分辨率显微镜。图6显示了测量的三维PSF。据我们所知，这是第一次准确地测量一个物体的三维PSF受激发射损耗直径小于30纳米的荧光微珠显微镜。

图7显示了理论PSF沿X、Y和Z方向的强度分布（根据受激发射损耗参数存在于文件的元数据中)，以及ATTO 647N GATTA - Beads的测量(蒸馏)PSF。与基于LIF文件元数据计算的理论PSF相比，蒸馏后的PSF基底轮廓更窄，X/Y中的FWHM更小。这表明一些估计受激发射损耗元数据中的参数(例如受激发射损耗饱和系数)，在给定的情况下，即775 nm，被低估了受激发射损耗激光能够比徕卡采集软件在该波长下假设的平均荧光团更有效地耗尽ATTO 647N荧光团。

为了测试使用测量的PSF是否改善了反褶积结果，对珠子样品中的不同区域进行了成像。使用Huygens Professional中的GPU加速Good's roughness Maximum Likelihood Estimation (GMLE)[9]算法，利用理论PSF和测量的(蒸馏的)PSF进行图像反卷积。反褶积结果的一个例子如图8所示。在这个例子中，用测量到的PSF反褶积后，可以在~65 nm处分离出两个紧密间隔的珠子，而使用基于元数据信息的理论PSF则不可能做到这一点。这个例子表明受激发射损耗当使用测量的PSF时，反褶积结果可以得到改善。

在图9中，显示了理论和测量（蒸馏）PSF的ATTO 542 PSF沿X、Y和Z轴的强度分布。在比较强度分布和半高宽时，观察到理论和测量PSF之间几乎没有差异，表明受激发射损耗对于该样本和成像条件，元数据的效率得到了很好的估计。请注意，选择仪器设置是为了获得一个好的数据集来提取数据受激发射损耗PSF，不是表示仪器可达到的最大分辨率。

使用测量的PSF和理论PSF对ATTO542胎圈样品的不同区域进行解卷积。比较如图10（c）和（d）所示。沿箭头指示方向的强度分布如图10（e）所示。可以使用理论和测量的PSF清晰地分离间距为170 nm的两个珠子。与理论PSF反褶积相比，测量的PSF反褶积结果显示出略好的对比度，表明受激发射损耗反褶积可以受益于使用测量的PSF，即使测量的PSF与理论PSF非常吻合。