用2D和3D纳米尺量化徕卡SR GSD 3D定位显微镜系统的分辨率

光学显微镜的主要问题之一一直是由衍射效应引起的有限分辨率，这是由恩斯特阿贝在1873年描述的［1］．这导致了一个问题，即高倍显微镜图像看起来模糊，并隐藏了各自样品的结构细节信息。近年来，一些突破阿贝衍射极限的技术得到了更高分辨率的显微图像。这些就是所谓的超分辨率技术使用物理的(即。发生的[２]或SIM[3])或化学方法(即GSDIM[4]或DNA-PAINT［5］)，以提高光学分辨率。这一突破被授予诺贝尔奖2014年化学奖。但长期以来，这些方法都存在一个问题，即对某一超分辨率显微镜所达到的分辨率没有标准化的定量测定方法。此外，通常不清楚哪种超分辨率方法最适合回答特定的生物学问题。到目前为止，证明超分辨率技术性能的最常见方法是对细胞骨架进行成像^［6］．因此，真核细胞骨架的结构如微管或肌动蛋白丝被成像衍射限制以及超分辨率的配置。然后，两幅图像一起显示(图1a, b)，以一种引人注目的方式，但只是定性地突出分辨率的提高。对于空间分辨率的定量测定，通常挑选出两根彼此平行且窄可分辨的细丝(图1c)并进行距离测量。通过这种方式找到的最短距离称为实现的空间分辨率(图1d)。

当然，这似乎是非常武断的，因为没有控制成像的细丝的分布，特别是它们之间的距离。此外，由于每个距离都是唯一的，因此不可能进行统计分析。对在各个方面开发更好分辨率标准的追求，让位于基于DNA折纸的超分辨率标准的开发[7]．

2006年，Paul Rothemund发明了在纳米尺度上构建这些确定结构的基本技术，即所谓的“DNA折纸”技术[8]．DNA折纸结构是由一个长(约7000到8000个碱基对)单链DNA分子构成的，即所谓的“支架链”(图2a)。通过向支架链的不同部分添加约200个具有互补序列的短单链DNA分子(称为“短链”)，支架的各个部分可以相互连接(图2b-d)。通过这些确定的连接，支架可以随意折叠成任何结构，通过正确选择短链序列来实现形状的编程。通过将支架链与短纤维链、缓冲液和盐一起加热，慢慢冷却到室温，折叠过程发生，DNA折纸结构折叠自我组装成设计的结构。

典型的DNA折纸结构的尺寸约为50至300纳米，可以有平面矩形、棒状、立方体，但基本上每种形状都有，如图3所示。

DNA折纸结构中每个短链的位置都是已知的，这一事实为定位有机分子提供了可能性染料分子在DNA折纸结构上达到纳米级的精度。因此，各自的短链需要用有机染料分子标记，然后在折叠过程中将其并入DNA折纸结构(图2e)。由于约200条短纤维链中的每一条都可以随意标记，DNA折纸结构可以被视为分子面包板，允许定位有机染料分子和基本上每一个可以以纳米精度附着在单链DNA上的物体(图2f)。这允许在DNA折纸结构上产生荧光标记，具有确定的距离和确定的染料分子数量，这是测试荧光，特别是超分辨率显微镜的可实现空间分辨率的理想结构。

由于DNA折纸技术的高度并行性，每张图像不仅包含一个纳米尺，而且包含数百万个相同的纳米尺，这确保了测量超分辨率显微镜可达到的空间分辨率的可能性，并计算这种测量的统计误差［6］．此外，成像缓冲液以及染料分子的密度可以调整到在实际样品中可以找到的条件。

GATTAquant GmbH是一家年轻的初创公司，专注于设计和制造基于DNA折188金宝搏怎么注册纸的纳米尺，用于任何类型的超分辨率显微镜。作为布伦瑞克理工大学Philip Tinnefeld教授团队的副产品，该公司在DNA纳米技术、光物理和超分辨率成像领域拥有丰富的专业知识，特别是两者的结合。188金宝搏怎么注册

这种专业知识导致了许多高质量的纳米尺产品的发展，不同的超分辨率方法发生的SIM卡,GSDIM(dSTORM)和DNA-PAINT，但也适用于传统衍射限制共聚焦显微镜(图3)[7]．

下面将更详细地解释基于定位的方法，特别是DNA-PAINT方法。基于定位的显微镜利用了这样一个事实，即单个染料分子的质心，尽管它在探测器上的信号是一个模糊点，但可以以高精度和远小于模糊点大小的标准偏差(取决于光子的数量)计算出来。目前，有机染料分子的典型定位精度(标准差)在5-10 nm范围内[9]．然而，为了计算有机染料分子的质心，我们必须确保在任何给定的时间点，只有一个染料分子在衍射限制点的区域内发光。为了确保这一点，重叠分子的发射必须通过诱导“闪烁”发射特性来暂时分离。然后对闪烁分子进行定位，最后通过定位得到超分辨图像。所有基于定位的超分辨率方法之间的主要区别在于它们使分子闪烁的方式。大多数技术(比如GSDIM，dSTORM或棕榈)利用分子在荧光开启状态和非荧光关闭状态之间的光物理切换，这是由光诱导或由化学反应诱导的。DNA-PAINT方法采用了完全不同的方法。在这里，要成像的结构不是直接用荧光分子标记，而是用单链DNA链作为互补的染料标记单链DNA的结合位点，即所谓的成像仪链。成像器链的长度足够短，只能短暂地绑定，从而导致在每个绑定位点上发生多个绑定和解绑定事件。由于成像仪链的有机染料分子仅在与表面的DNA折纸结构结合时可见，在溶液中自由扩散时不可见，因此这种结合位点具有与单个闪烁染料分子相似的发射特性(图4)。［5］．

然而，与单个闪烁染料分子相比，它有几个优点。最重要的一点是，DNA- paint样品不容易发生染料漂白，因为每当新的成像仪链与DNA折纸结构结合时，有机染料分子就会发生交换。此外，该技术只需要一个励磁源，多路复用非常简单。基于DNA-PAINT技术，gta - paint系列提供了包含三个标记的纳米尺，标记到标记的距离为20 nm, 40 nm或80 nm。为了测试基于定位的显微镜在基于3D定位的超分辨率中可实现的空间分辨率，GATTAquant目前开发了可提供轴向标记间距的纳米尺。一种很有前途的DNA折纸结构具有轴向距离为80纳米的四面体的形状。

一个常见的问题，特别是在基于定位的超分辨率显微镜中——图像记录时间很容易超过几分钟——是由机械和/或热不稳定性引起的横向和轴向样品漂移问题，导致不包含任何可解析结构的涂抹图像。

通过使用漂移稳定成像平台(配备了抑制运动(SuMo)舞台的徕卡SR GSD 3D)或使用自动对焦，可以避免图像采集过程中的漂移。通过对所获得的数据进行后处理，可以在图像采集后进行横向漂移校正。因此，作为参考点的所谓基准标记被添加到样本中。在图像采集期间，基准被定位在每一帧，从而产生每个基准标记的x和y坐标的时间痕迹。然后将所有选定基准标记的单个轨迹组合为x坐标和y坐标的单个时间轨迹。

对两者都计算补偿曲线，这通常是通过多变量拟合或一些滑动平均算法来完成的。然后从超分辨率图像内的所有坐标中减去该补偿曲线。常用的基准标记是荧光珠，即充满染料分子的纳米球。然而，它们有一些缺点:荧光信号通常太亮，即它饱和了检测器，其动态范围优化为单分子检测。随着时间的推移，珠子的信号不是恒定的，并因光漂白效应而降低，而且珠子通常不能完美地粘在表面上，即它们的位置随着时间的推移不稳定。

这些缺点可以通过使用基于dna折纸的DNA-PAINT基准标记(以下称为PAINT-FMs)来克服。PAINT-FM是dna折纸结构，携带多个DNA-PAINT结合位点，确保在DNA-PAINT条件下，任何给定时刻都有一对染料分子位于PAINT-FM上。这产生了来自PAINT-FM的非漂白荧光信号，其亮度足以确保对PAINT-FM进行足够精确的定位，但对探测器来说又不会太亮。此外，PAINT-FMs可以通过生物素-中性蛋白-生物素结合稳定地连接到表面，即它们随着时间的推移保持稳定的位置。与传统珠子相比，这些优势使PAINT-FMs与GATTA-PAINT纳米尺结合成为基于定位的超分辨率显微镜的理想测试样品。

本文中gta - paint纳米尺的测量是在徕卡DMi8全自动徕卡SR GSD 3D显微镜上进行的TIRF系统允许结合2D和3D超分辨率与TIRF以及斜照明显微镜。高功率激光器在各种激光线允许有效切换广泛的荧光团和收集许多光子最高的定位精度。三维定位测量是由一个基于散光的光学特征使用圆柱形透镜。

TIRF显微镜使用倏灭波选择性地照亮和激发荧光团在试样的一个限制区域内，直接毗邻玻璃-水界面。当入射光以大于临界角的角度与玻璃-水界面相遇并被完全反射时，就会产生这种倏灭波。它在z方向上的传播逐渐退化，因此穿透深度受波长、折射率、物镜的数值孔径和入射光的角度的影响而限制在几百纳米左右。

TIRF显微镜通常用于成像质膜内和靠近质膜的动态事件，如囊泡运输，膜运输和内吞作用。

然而，为了精确地描述所观察到的分子的定位，必须可靠地控制倏逝波的穿透深度。188金宝搏的网址徕卡微系统提供了一个完全自动化的特殊硬件TIRF由TIRF扫描仪、准直仪、传感器和穿透深度可通过自动化软件控制进行精确设置。

全内反射发生的确切位置的知识可以用于样品的特殊照明，所谓的hilo样模式提供斜照明。

徕卡拉斯维加斯X成像和分析软件提供了几个选项来设置TIRF和斜照明(图6)。自动模式使研究人员可以通过选择预定义的穿透深度之一来定义消失波穿透到样品的深度。专家模式允许以纳米精度定义消失波的穿透深度(通过移动绿色区域中的滑块)。当滑块移出绿色区域时，可以定义斜照明的角度。这个角度低于临界角度，激光会倾斜通过试样。自由定义的TIRF扫描仪还提供了在两种模式下选择消失场方向(方位角)的可能性。

通过将这些技术与GSD结合使用，当它们像DNA-PAINT一样标记其目标时，可以对单个荧光团进行高分辨率的实时成像和跟踪。

为了进行GSD超分辨率测量，必须将包含准备使用gta - paint纳米尺的载玻片(图7a)固定在SuMo样品台的插入件中。不需要进一步的样品制备。在图像采集过程中，通过软件调整相机和成像设置，确定穿透深度，直接重建超分辨率图像。单发射极信号采用高斯或质心算法进行拟合。

测量完成后，将数据显示在多色图像中(图7b)，并使用GATTAnalysis软件工具进行分析。因此，将保存为电子表格文件的本地化数据导入到GATTAnalysis，以确保数据文件的不同列正确地连接到各自的数据集。导入完成后，数据在主用户界面以图像的形式显示。第二步在图像中检测到纳米结构。这既可以由寻点器完全自动完成，也可以通过单击各自的结构手动完成。然后对所选结构进行标记到标记的距离和每个标记的全宽半最大值FWHM(全宽半最大值)分析。通过对这些值的统计分析，结果与设计距离值进行了比较(图7c, d)。对gta - paint 40RG纳米尺的测量进行的比较表明，徕卡GSD显微镜能够轻松地横向分辨样品，红色通道和绿色通道的设计距离为40 nm。

如果距离远远小于40nm，通常横向漂移就会成为一个重大问题。因此，我们用GATTA-PAINT 20R纳米尺将PAINT-FMs添加到样品中。然后在徕卡SR GSD显微镜上测量该组合样品，测量后进行后处理以校正横向漂移(图7e-g)。这一测量证明，20nm距离的分辨率与较大距离的分辨率一样好。然而，未校正的数据表明，在这种情况下，充分的漂移校正是必不可少的。

此外，还在徕卡GSD装置上测量了三维DNA折纸结构。该结构为边长为100 nm的四面体，每个顶点上都有荧光标记(DNA-PAINT结合位点)[10]．轴向距离为80 nm。这个结构也很容易被徕卡SR GSD 3D解决(图8b)。

为了在3D中捕获超分辨率图像，在发射光束路径中插入一个圆柱形透镜，引入散光。对于每一个不同的z-位置，测量信号光斑的形状，这最终导致了光斑形状与z-位置之间的相关性。这种相关性可以用于染料分子的轴向定位(图8a)。

对于定量距离测量，由于折射率引起的影响，获得的z值必须进行校正。这是由于以下原因:在测量发射器z坐标的绝对值之前，必须对系统进行校准。这是通过获取三维荧光珠来完成的。得到的PSF形状的值作为轴向位置的函数，然后用于计算样品分子的坐标。然而，由于用于校准的珠子是直接附着在表面上的，因此没有光通路穿过溶液，就像在最终的超分辨率测量中那样。这导致校准和测量之间衍射指数不匹配。为了克服这种影响，所有的z值都必须通过一个可以根据Schmied, Forthmann等人确定的特定因素进行校正。[11]．在此测量中，校正系数确定为0.42。经校正，测得的标记距离与四面体的理论值相符。

在用先进的显微镜技术打破阿贝衍射势垒之后发生的，GSDIM/dSTORM超分辨率成像的主要问题之一是缺乏一种标准化的方法来量化可实现的空间分辨率。布伦瑞克理工大学的研究人员通过开发基于DNA折纸的纳米尺来解决这一问题，目前该纳米尺已由GATTAquant公司商业化。188金宝搏怎么注册我们在徕卡SR GSD 3D系统上演示了这些纳米尺，显示这些结构是理想的分辨率标准，验证了徕卡设置是一个非常出色的成像系统，横向分辨率优于40 nm，轴向分辨率优于80 nm。

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