利用立体和共聚焦显微镜有效地研究发育生物学:秀丽隐杆线虫

蛔虫Caenorhabditis elegans.被用作神经科学，发育和分子生物学和遗传学的模型生物体超过40年［１］．它是第一个对整个基因组进行测序的多细胞生物［２］而且，直到现在，是唯一的生物体，其连接体，即神经系统中的神经元连接图，被完全绘制出来［3］．蠕虫是一种终末期生物，其细胞数量在遗传上是固定的，其神经系统包含302个神经元(神经细胞)。蠕虫被用作研究神经发育、细胞分化、细胞凋亡(程序性细胞死亡)、衰老等的模型生物。大量的基因秀丽隐杆线虫能以与哺乳动物相似的方式工作。大约三分之一的基因秀丽隐杆线虫基因组与一些人类基因同源（衍生自共同祖先），结果使蠕虫可用作对人类相关疾病研究的模型生物体。蠕虫在实验室中培养很容易，快速培养，通常保持在室温以下（15-20°C）。成年蠕虫的长度约为1毫米，直径小于75μm。它们保持在琼脂平板上，即培养皿内的琼脂凝胶，细菌(大肠杆菌)作为食物。

对于蠕虫的常规实验室工作有几个常见的步骤(图1):

1. 挑选蠕虫［４］；
2. a）转子(5、6):将转基因基因微量注入蠕虫体内，以修改其基因组;
   b) RNA干扰(RNAi)[7]：将双链（DS）RNA引入蠕虫以抑制基因表达;
3. 筛选:评估蠕虫以检测成功的RNAi或转基因;
4. 用各种方法研究蠕虫的分子生物学、生物化学、遗传学;
5. 蠕虫的文档或功能性成像，通常用共聚焦或复合显微镜进行。

上面显示的工作步骤并不一定是以线性顺序完成的，也就是说，一个非线性的“工作流”。首先，必须选择和“挑选”蠕虫，然后是基因或蛋白质表达的操纵，然后繁殖蠕虫一段时间。然后，通过表型(可观察的特征)来区分这些蠕虫，以找到那些具有人们追求的特征的蠕虫。如果这些蠕虫数量太少，则可以重复前面的步骤。当有足够数量的蠕虫具有感兴趣的特征时，再次“挑选”它们，固定，最后进行功能成像。

下面的照片(图2)展示了德国康斯坦斯大学分子微生物系的一个典型的蠕虫实验室。

工作效率的优化将取决于应用和使用，即无论是实验室研究还是课堂教学。

蠕虫的培养和成像一般

在培育、采摘、筛选蠕虫等方面有几点需要考虑:

• 更换琼脂培养皿时避免重新聚焦→每个培养皿中相同数量(相同高度)的琼脂
• 获得蠕虫的清晰显微镜图像→琼脂上较低浓度的细菌(食物)
• 降低蠕虫成像板的荧光背景(自体荧光)→薄琼脂层，无蛋白胨[4]
• 必须将蠕虫与琼脂区分开来——对透射光来说，良好的对比很重要
• 检测较弱的荧光信号以获得更好的图像结果→良好的荧光信噪比(S/N)和黑暗背景临界
• 在较高总放大率下的成像蠕虫时确保良好的对比度和高分辨率（以上60倍）

研究实验室

当选择合适的蠕虫和准备他们的遗传或生物化学分析,通常选择蠕虫使用立体显微镜,挑小的铂丝或睫毛(图3)。然后,通过显微注射转基因蠕虫的性腺,它们被放置到一个小,干载玻片上的琼脂板(图3)。

教学需要不同于研究应用的考虑。需要减少琼脂或蠕虫采摘器污染显微镜光学的风险。的徕卡S6立体声显微镜[8]例如，提供了一个方便的工作距离，高倍放大，和大的景深，以帮助应对这些挑战和有效工作。结合Leica LED2500照明[9](图4)徕卡S6为教室和教学实验室的采虫提供了很好的解决方案。没有经验的学生更喜欢高放大倍数而不是高分辨率。因此，我们推荐使用放大倍数为16倍的目镜，而不是更常见的只有10倍的目镜。

通过徕卡微系统的几个立体显微镜系统，可以实现对蠕虫的快速筛选。188金宝搏的网址徕卡S6常规立体显微镜[8]与徕卡LED2500灯架，或小照明底座(图5)是非常实用的蠕虫筛选[9]．当使用1.6倍的前镜头配件时，它可以提供更高的放大倍数和分辨率。由于设计紧凑，S6在实验室中占用的空间也更小。用这些显微镜，即使是在低倍率下，也可以很容易地得到高对比度的蠕虫图像。对于教师来说，它们是特别好的解决方案。

下表列出了在亮场使用徕卡S6显微镜时，使用徕卡LED2500光源或底光源照明的不同优势。

有效的蠕虫筛选也可以实现与Leica M80立体声显微镜［10］用一个徕卡TL3000 ST灯座(图6)［11］．徕卡M80有一个共同的主物镜(CMO)，所以没有倾斜的对焦平面，整个视场对双眼都很清晰。此外，该系统是模块化的，允许您灵活地添加，交换或更换组件非常迅速。如果需要多个用户同时观察标本图像，并记录高分辨率图像用于报告，则可以安装数码相机。例如,一个徕卡MC 170/190高清相机［12］500万像素或以上的像素可以同时产生高清(HD)实时图像和录制图像。

有几种方法可以改变蠕虫的基因/蛋白表达。稳定和瞬态基因改性用微量注射进入蠕虫进行。这两种主要方法是：转座子[１３]，也被称为跳跃基因，或CRISPR/Cas9［14］系统。使用CRISPR的转基因产量较低，需要一个代周期进行选择，但插入转基因更加稳定。转座子方法效率高，产量高，需要注入更少的蠕虫，但并不总是清楚转基因整合到基因组的位置。

一旦蠕虫被放置在玻璃载玻片上干燥的琼脂垫上，重要的是要迅速工作，否则蠕虫可能会在过程中干燥和死亡。为了减缓蠕虫的干燥速度，通常它会被涂上油，如卤代烃或石蜡[６]．通常，微注射应在5分钟内完成。将带有琼脂垫的载玻片放置在倒置显微镜的台子上，定位一条蠕虫，然后将转基因(DNA)注入远端性腺。

然后蠕虫被恢复缓冲解决方案覆盖[６]，用铂金属丝或睫毛挑选并放置在单个琼脂平板上，以进一步培养和繁殖。该工作步骤通常在具有差分干扰对比的手动倒复合显微镜上进行（迪拜国际资本）［15］或集成调制对比度（IMC）照明[16]，例如徕卡DMi8(图7)或徕卡DM IL LED[17]．强烈建议在显微镜下安装防振动装置，以获得更高的产量。

对于针头的精确定位用于显微注射，使用高精度，3轴，油气操纵器，例如来自Narishige仪器的实际。

RNA干扰(RNAi)是用来改变蛋白质表达在翻译水平。它是通过给蠕虫喂食表达双链(ds) RNA的转基因细菌来完成的。蠕虫摄取dsRNA后，它进入蠕虫的所有细胞(神经元除外)，经过细胞生化处理，然后产生短干扰RNA (si)。siRNA一旦出现在细胞中，就会改变蛋白质的表达。

注射后，蠕虫被进一步培养，下一代被用于实验。为了繁殖，这些蠕虫被保存在20°C。蠕虫必须避免干燥，所以琼脂皿通常存放在塑料盒中。为了获得大量的蠕虫，在锥形烧瓶中进行液体培养是第二种可能。

大约5只蠕虫就足以进行蛋白质印迹分析(鉴定蛋白质)［18］．然而，需要10万只蠕虫进行差动梯度离心，以按密度分离细胞器和蛋白质[19]．

因为转基因通常与绿色荧光蛋白(绿色荧光蛋白）［20］它们可以用荧光立体显微镜进行选择。其他的荧光标记，如DsRed［20］高表达水平会有毒性吗绿色荧光蛋白是选择的标志。

蠕虫必须使用亮场和Rottermann对比度(大视场[FOV])定位，检查荧光信号，然后选择用于其他实验。对于成像，年轻的蠕虫通常是首选，因为年长的蠕虫通常表现出更高的自身荧光，特别是在肠道。选择的蠕虫被放在特殊的小琼脂皿中，没有蛋白胨也没有细菌，以减少自身荧光。琼脂层通常很薄，以进一步减少自身荧光。

高效的荧光筛选蠕虫可以用徕卡M165 FC.［21］或徕卡MZ10 F.［22］荧光立体显微镜使用徕卡TL4000 RC［11］光基(图8)。

• 由于徕卡M165 FC/徕卡TL4000设置的许多照明对比度可能性，一个蠕虫的单细胞很容易区分。
• 徕卡M165 FC或徕卡MZ10 F/徕卡TL4000组合非常实用和高效的高级文档和成像对比度的快速切换。
• 由于采用TripleBeam技术，具有最高的信噪比(S/N)，因此具有强烈的荧光信号［23］→分离激励和观测光束路径。

的视频秀丽隐杆线虫可以通过YouTube观看琼脂培养皿上的蠕虫，只要点击下面的视频。只有荧光发射的光被检测到，没有其他照明使用(暗背景)。视频中看到的大多数蠕虫的肠道中都有一些自体荧光［24］．只有一个蠕虫是双阳性的，并且还显示出来自荧光蛋白麦克里的明亮信号［20］表现在它的咽。该视频是用徕卡M205 FA荧光立体显微镜和徕卡DMC4500数码相机拍摄的。视频回放的速度比原始记录的速度略快，所以蠕虫可能看起来比现实中移动得快。

• 为了达到最高的对比度和分辨率，一个具有复杂结构的透射光基座就像一个高倍放大的光聚光器。
• 很少或没有背景光“噪声”的荧光成像是由徕卡TL基产生的
• 当使用徕卡TL4000 RCI时，在高倍率下可以获得更好的对比度和更高的分辨率图像［11］基于其双面镜的凹面侧。
• 避免加热蠕虫时，不希望使用的莱卡TL4000 RC底座与外部光源。
• 对于高自发荧光的情况，降低荧光激发强度会增加信噪比。在很多情况下，蠕虫的荧光信号是最大的，不能增加更多，但背景总是可以。
• 根据预算和个人用户的需求，徕卡TL3000 ST，徕卡TL4000 BFDF［11］，以及徕卡TL4000 RC灯座均可使用。

共聚焦和复合显微镜，如徕卡TCS SP8或徕卡TCS SPE共聚焦系统［25］以及徕卡DM6或徕卡DM2500立式复合显微镜［26］，通常用于蠕虫的成像和记录，以获得亚细胞和大分子结构的高分辨率图像。

对于共焦成像，蠕虫表达荧光蛋白，即。绿色荧光蛋白，红色荧光蛋白（RFP，MCHERRY或DSRED），黄色荧光蛋白（YFP）或青色荧光蛋白（CFP）［20］，如上所述(图9和10)。

具有直立结构的共聚焦显微镜是更好的，因为蠕虫在皿中琼脂层的顶部。蠕虫的移动速度相对较快，所以它们通常会被药物左旋米索麻醉，然后用一个覆盖物盖住它们，用液体浸没物镜观察。

幼虫阶段的蠕虫对光线非常敏感，因此使用共聚焦共振扫描仪[27]，由于速度短，可以将光毒性的问题降低到最低限度。谐振扫描仪允许长期观察秀丽隐杆线虫幼虫无明显损害。

常见的方法秀丽隐杆线虫[29]使用立体、复合或共聚焦显微镜，涉及多个工作步骤。蠕虫实验室的需求各不相同。可以使用几种配置和工具来处理工作步骤中完成的特定任务。

下面是常用的显微镜溶液列表:

• 使用产生高对比度的透射光基，通常使用绿藻立体显微镜（例如Leica S6）进行蠕虫拣选。Leica TL3000 ST;
• 通过倒置的化合物显微镜（例如Leica DMI8）实现转基因微注射，使用微操纵器到定位针和用于DNA的注射器。此外，集成调制对比度是选择的照明方法;
• 荧光筛选可以用一系列荧光立体显微镜完成，如徕卡mz10f或徕卡M165 FC，使用透射光底座实现非常好的对比度，如徕卡TL4000 RC;
• 亮场筛选通常使用普通的主物镜(CMO)立体显微镜，如徕卡M80，具有高对比度透射光基，如徕卡TL4000 RC;
• 功能成像，即用于细胞分化、凋亡(程序性细胞死亡)、衰老、神经元活性等研究的转基因蠕虫的特征，是通过直立化合物或共聚焦显微镜完成的，如徕卡DM6或徕卡TCSSP8;
• 固定化的蠕虫也可以用高性能的荧光立体显微镜，如徕卡M205 FA和透射光基，以合理的分辨率成像。徕卡TL5000因此[11];
• 对于图像蠕虫胚胎，建议使用共焦谐振扫描仪以低光毒性;和
• 对于教室，教学实验室和培训，显微镜设置要求可能因研究实验室而异。

这个简短的报告可以作为一个有用的参考或指导方针，当建立一个蠕虫实验室，并解释了有效地执行必要的工作步骤所需的各种仪器。

我们要感谢加拿大卑斯省伯纳比西蒙弗雷泽大学生物科学系Harald Hutter教授提供线虫大脑和神经系统的共焦图像。

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